艾沐蒽ImmuHub®免疫组测序平台联合液相色谱质谱（LC-MS / MS）来表征抗噻虫啉重组抗体（mAb）BCR特性，并发现可变区（VR）序列的互补决定区（CDR）中的Ser52（H-CDR2），Trp98和Trp93（L-CDR3）残基主要通过CH–π作用来有助于噻虫啉特异性识别。
摘要
重组抗体(rAbs)测序 ，已成为杂交瘤分泌的单克隆抗体(mAbs)的替代品来进行免疫分析。杂交瘤的多倍体特性往往导致畸变或非特异性功能变量区(VR)基因转录本共存，VR序列的识别从而变得更加复杂。因此，文章介绍了结合ImmuHub®二代测序技术，使用LC-MS / MS来表征抗噻虫啉单克隆抗体VR序列的特性，该单克隆抗体由一个具有遗传抗体多样性杂交瘤产生。
通过基于HEK293哺乳动物细胞表达重组抗体(rAb)进行功能分析，来验证VR序列。rAb的性能与亲本单抗相似，ELISAs测量的IC50值分别为0.73和0.46°g/L。此外，分子分析揭示了互补决定区 (CDR) 中的Ser52 (H-CDR2) 、Trp98和Trp93 (L-CDR3) 残基在已识别的VR序列中，主要通过氢键和CH-π 相互作用，促进噻唑啉特异性识别。通过单位点丙氨酸诱变，还发现了Trp98和Trp93 (L-CDR3)对硫虫啉具有较高的亲和力，Ser52 (H-CDR2)对特异性结合有辅助作用。本研究提出了一种高效可靠的方法来确定半抗原特异性单克隆抗体的关键识别位点，有助于改善抗体特性。结果：
1.VR基因克隆类型与丰度
对抗噻虫啉杂交瘤 C4C4进行免疫组二代测序分析，通过艾沐蒽ImmuHub®平台BCR特异性的分子条形码(UMBs)进行调整，纠正PCR扩增和测序过程中的错误。CDR3是最具多样性的区域，含有V-(D)- J片段，用于鉴定不同的克隆，图1中，Thicaloprid- C4C4 -lambda (λ)文库，共享克隆CDR3氨基酸序列为“CALWFGNLWVF”，Thicaloprid-C4C4-kappa(κ)文库中共享克隆CDR3氨基酸序列为“CVQGSHFPHTF”，Thicaloprid- C4C4 – H文库，其中99.88%共享克隆CDR3序列“CARITYPFFPMDYW”，然而排在第二位克隆序列“CSRGGLYYDYDAWLGYW”，却只有0.11%的丰度。
2. 感兴趣的VL和VH克隆的全长序列
使用免疫遗传信息系统(IMGT)对扩增的VH和VL产物进行全长核苷酸序列分析。并根据Kabat规则对VH和VL的CDR进行注释。
使用二代测序结果，扩增感兴趣的序列克隆,命名为“SP-thiacloprid-C4C4 VH – 99.88% (99.88%克隆丰度VH的特定引物扩增全长序列)”、“SP-thiacloprid-C4C4 VH – 0.11% (0.11%克隆丰度VH的特定引物扩增全长序列)”,和“SP-thiacloprid-C4C4 V-λ 100%(100%克隆丰度 V-λ的特定引物扩增全长序列)”。在比较实验中，利用引物set 1，得到3条VH序列和1条VL序列，命名为“1-thiacloprid-C4C4”。利用引物set 2，得到VH和VL各一个序列，命名为“2-Thiacloprid-C4C4”。氨基酸序列分别在NCBI数据库中用Protein BLAST比对，序列同源性显示，除“1-thiacloprid-C4C4 VH-1-C”与双峰驼的Ig VH高度同源外，大部分序列与小鼠的Ig VHs或VLs高度同源。
再使用BioEdit软件对各组氨基酸序列进行比对，发现这6条VH序列有显著性差异(图2)。SP-Thiacloprid-C4C4 VH-99.88%为相关克隆“CARITYPFFPMDYW”的全长序列（在Thiacloprid-C4C4-H NGS文库中具有99.88%的丰度），与“2-Thiacloprid-C4C4 VH” 相似。SP-Thiacloprid-C4C4 VH-0.11%为相关克隆“CSRGGLYYDYDAWLGYW”的全长序列（在Thiacloprid-C4C4-H NGS文库的第二位置，丰度为0.11%），与“1-thiacloprid-C4C4 VH-3-C”一致。图2B中，VL的鉴定超过97%，只有FR1开始处的2个氨基酸有差异。SP-Thiacloprid-C4C4 V-λ100%为相关克隆“CALWFGNLWVF”的全长序列，与“2-Thiacloprid-C4C4 V-λ”完全相同。
—–总结 —–
文章提出LC-MS/MS结合NGS和特异性PCR，可以作为一种完整而准确的方法，来快速分析具有不同抗体基因杂交瘤中半抗原特异性VR基因序列。所表达的全长rAb表现出与亲本mAb对抗噻虫啉相似的性能，这表明rAb可以进一步用于建立多种免疫分析方法，以快速检测农业和环境样品中的噻虫啉残留。计算机分子对接和单定点丙氨酸诱变的结果表明Trp93 (L-CDR3) 、Trp98 (L-CDR3) 和Ser52 (H-CDR2) 位于抗体中的Fv主要负责噻虫啉的特异性识别。这一发现也证明了LC-MS/MS结合NGS二代测序技术的方法能够可靠地鉴定VH和VL序列以及核心氨基酸。
参考文献：Liu, P.; Guo, Y.; Jiao, S.; Chang, Y.; Liu, Y.; Zou, R.; Liu, Y.; Chen, M.; Guo, Y.; Zhu, G. Characterization of Variable Region Genes and Discovery of Key Recognition Sites in the Complementarity Determining Regions of the Anti-Thiacloprid Monoclonal Antibody. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, https://doi.org/10.3390/ijms21186857