近期，由成都医学院和厦门大学医学院等团队在Aging Cell上发表题为“Perp Deficiency Induces Defective Negative Selection and Autoimmune Arthritis in Aged Mice”的研究，该研究采用了艾沐蒽ImmuHub® TCR测序分析平台，研究团队通过构建条件性敲除小鼠模型发现：Perp基因的缺失，会直接导致胸腺CD4单阳性T细胞的阴性选择出现缺陷，自身反应性克隆无法被有效清除；随着年龄增长，这些异常累积的活化CD4⁺T细胞最终会引发自身免疫性关节炎。这一发现不仅明确了Perp在维持中枢免疫耐受中的关键角色，也为衰老相关自身免疫病的发病机制提供了新的视角。
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摘要
胸腺阴性选择是清除自身反应性T细胞、维持免疫耐受的关键过程，凋亡相关基因在此扮演重要角色。Perp蛋白兼具凋亡诱导与肿瘤抑制功能，其表达受p53调控。研究团队构建了条件性Perp敲除小鼠模型，发现敲除小鼠胸腺CD4单阳性T细胞异常累积，阴性选择过程受损，自身反应性T细胞未被有效清除。随着年龄增长，敲除小鼠外周血活化CD4⁺T细胞过度增殖，最终自发发展出T细胞介导的自身免疫性关节炎。该研究揭示了Perp基因在胸腺免疫耐受中的关键作用，为年龄相关性自身免疫病提供了新的机制解释。
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背景
Perp是一种细胞膜上的四跨膜蛋白，受p53、p63调控，既是维持上皮稳态的关键分子，也是重要抑癌因子，可参与细胞凋亡调控，其在多种肿瘤中表达下调，会帮助肿瘤细胞早期逃逸凋亡。
Perp广泛存在于各类组织和免疫器官中，团队前期研究发现，T细胞特异性敲除Perp后，Th17细胞抗凋亡能力增强、外周CD4⁺效应记忆T细胞存活优势提升，会加重自身免疫性炎症损伤，说明Perp对T细胞发育和功能稳态影响显著。
已知p53通路与免疫衰老相关，而Perp表达降低会提升CD4⁺效应及记忆T细胞存活率，关联免疫耐受失衡。据此研究提出假说：Perp低表达会破坏胸腺阴性选择，增加自身免疫病风险，且衰老会加剧这一趋势。
为此，研究构建T细胞特异性Perp敲除小鼠模型，结合TCR转基因小鼠追踪特异性T细胞克隆，旨在明确Perp调控胸腺阴性选择的机制，以及其在自身免疫病发生中的关键作用。
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材料与方法
1.实验动物
小鼠来源规范，SPF饲养，随机分组，符合伦理。
2.模型构建与动物实验
经辐照构建骨髓嵌合小鼠，建立OT‑II阴性选择模型，注射OVA肽诱导免疫，为机制研究提供动物基础。
3.流式细胞术
实验选用多家品牌流式抗体、凋亡及细胞增殖检测试剂盒等核心试剂；主要依托流式细胞术完成细胞表型、活化及凋亡分析，配套专用仪器与软件进行数据采集处理。
4.分子与组学检测
（1）采用免疫印迹实验，检测胸腺及脾脏T细胞中凋亡、衰老及通路相关蛋白表达；
（2）采用ImmuHub TCR高通量分析系统（杭州艾沐蒽生物科技）借助独特分子条形码校正误差，对TRB基因进行深度测序分析。
流程：采用基于5’RACE的无偏扩增方案，在cDNA合成过程中引入唯一分子标签（UMB），以消除PCR与测序错误，并控制扩增偏差。测序在Illumina NovaSeq平台上以PE150模式进行。
5.功能与分子表达验证
通过麻醉小鼠开展唾液流率检测，评估机体生理功能；利用荧光定量PCR技术，提取多组织及分选T细胞的RNA，反转录后检测关键转录因子mRNA表达水平，从分子层面佐证Perp基因对T细胞免疫调控的作用。
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研究结果
1.Perp缺失扰乱胸腺T细胞正常发育
p53可直接结合并激活Perp转录，而Perp在胸腺细胞发育中的作用此前尚不明确。研究发现，敲除Perp会使小鼠胸腺总细胞数上升，CD4单阳性T细胞数量近乎翻倍，双阴性胸腺细胞比例也明显升高；同时部分胸腺细胞亚群前TCR信号活化特征发生改变，且Perp与p53基因敲除通过不同机制影响胸腺淋巴细胞发育。
2.Perp差异化调控胸腺T细胞克隆清除
胸腺发育中绝大多数T细胞会通过凋亡被清除，Perp缺失可显著抑制胸腺细胞凋亡，对CD4单阳性T细胞作用最突出。其机制与BCL-2家族及caspase凋亡通路密切相关：Perp敲除后促凋亡蛋白表达下调、抗凋亡蛋白上调，且其他p53下游促凋亡基因无法代偿Perp缺失的功能。
3.Perp决定高亲和力T细胞的阴性选择命运
借助OT-II嵌合小鼠模型证实，Perp缺失会让高亲和力自身反应性T细胞逃逸阴性选择，凋亡水平大幅降低；且该调控过程依赖TCR亲和力，只影响阴性选择，不干扰胸腺阳性选择进程。
4.Perp缺失引发异常T细胞亚群扩增与TCR谱偏移
Perp敲除小鼠Helios阳性成熟CD4单阳性胸腺细胞显著扩增，自身反应性T细胞不断累积；同时外周CD4⁺T细胞TCR受体谱发生偏移，多种与自身免疫病相关的TCR亚型占比升高，疾病易感风险随之增加(FIGURE5)。
FIGURE5A.TRB基因N区插入长度分布
两组小鼠N区长度分布曲线几乎完全重合，说明Perp基因缺陷并不会直接影响TCR基因重排的N区插入机制，TCR库多样性受损，并非发生在基因早期重排阶段。
FIGURE5B.TCR克隆分布特征
对照组小鼠TCR克隆色块分布均匀，无优势克隆富集；Perp敲除实验组则出现明显大片块优势克隆。提示Perp基因缺失会引发TCR库克隆性扩增，少数TCR克隆占比异常升高，根源是胸腺阴性选择功能异常，自身反应性T细胞克隆无法正常清除，出现异常蓄积。
FIGURE5C.多样性指数与V基因使用频率
香农指数是评判TCR库多样性的关键指标，数值越高代表克隆分布越均匀、多样性越强。实验结果显示，Perp缺陷小鼠香农指数显著低于对照组，直接证实Perp缺失会造成TCR库多样性下降、克隆分布失衡。
在TCRβ链V基因片段使用上，实验组多个TRBV基因使用频率异常升高，出现明显V基因使用偏倚，说明特定TCR克隆被选择性保留并扩增，进一步佐证阴性选择缺陷引发的克隆清除障碍。
FIGURE5D.TRBV-J基因配对热图
对照组小鼠V-J基因配对整体分布均衡、无明显偏好；Perp敲除组出现多处高表达暖色区块，存在特定V-J配对偏好性使用，与V基因偏倚结果相互印证，明确TCR库克隆选择过程发生显著异常。
FIGURE5E.特定TCR Vβ亚群流式验证
对测序筛选出的Vβ8.1/8.2、Vβ2、Vβ12等异常亚群进行流式检测发现：Perp 敲除小鼠体内对应Vβ⁺CD4⁺T细胞比例显著低于对照组。
该结果看似矛盾，实则为重要机制验证：测序反映的是少数异常克隆的特异性扩增，流式检测的是整个Vβ亚群总体占比。说明Perp缺陷仅造成特定自身反应性克隆异常扩增，并非整个Vβ亚群普遍紊乱，阴性选择障碍具有克隆特异性。
核心总结
Perp基因缺陷会明显下调TCR库多样性，诱发克隆性扩增、V基因及V-J基因配对使用偏倚；这种免疫库异常与TCR早期基因重排无关，根本原因是胸腺阴性选择功能受损，自身反应性T细胞克隆无法正常清除、异常累积。
5.中年Perp敲除小鼠自发出现自身免疫病变
随年龄增长，中年Perp条件敲除小鼠外周活化CD4⁺T细胞大量累积，Th1、Th17细胞比例上升，多组织出现炎症浸润与损伤，诱发T细胞介导的自身免疫性关节炎；同时细胞衰老相关分子表达上调，衰老进一步放大免疫耐受缺陷，加重自身免疫病进程（FIGURE6A-B）。
FIGURE6A.外周T细胞活化异常
流式分析显示，Perp敲除小鼠外周CD4⁺T细胞中，CD44高表达、CD62L低表达的效应/记忆性T细胞比例显著升高，表明自身反应性T细胞被持续激活,这是自身免疫病的典型表现。
FIGURE6B.脾脏T细胞亚群失衡
对脾脏CD4⁺T细胞检测发现，Perp敲除小鼠的Th1（IFN-γ⁺）、Th17（IL-17A⁺）促炎细胞比例明显升高，而Treg（Foxp3⁺）抑炎细胞比例无变化。这种促炎/抑炎失衡，正是自身免疫炎症的直接诱因。
05
讨论
1.Perp核心调控胸腺阴性选择与免疫耐受
胸腺阴性选择中的细胞凋亡，是清除自身反应性T细胞、建立机体免疫耐受的核心环节。本研究证实，Perp基因缺失会造成小鼠胸腺CD4单阳性T细胞大量蓄积，显著影响T细胞克隆清除过程，尤其对TCR信号刺激下的CD4单阳性T细胞存活调控作用突出；高自身反应性Helios阳性T细胞明显扩增，高亲和力T细胞可逃逸阴性选择，且该过程严格依赖TCR与抗原的结合亲和力。
2.Perp对不同T细胞亚群存在差异化调控
Perp敲除主要影响CD4谱系T细胞发育，使其相比CD8⁺T细胞获得明显存活优势，凋亡能力显著下降，但不影响中等亲和力自身反应性T细胞及胸腺细胞正常增殖。强TCR信号本易触发阴性选择凋亡，而Perp缺失可有效挽救高亲和力CD4⁺T细胞克隆存活，进而改变体内CD4/CD8 T细胞比例平衡。
3.免疫耐受代偿失衡诱发年龄相关性自身免疫病
Perp敲除对胸腺调节性T细胞生成无明显影响，其轻微增多仅为免疫耐受的代偿反应。随着年龄增长，中年小鼠出现活化CD4⁺T细胞过度累积，叠加老年Treg细胞抑制功能衰退，多重因素共同打破免疫稳态，最终诱发T细胞介导的自身免疫性关节炎。
4.Perp兼具免疫调控与抑癌双重生物学功能
Perp作为经典抑癌因子，可通过调控凋亡通路影响肿瘤细胞存活；同时在免疫系统中，它能调控T细胞凋亡与稳态平衡。与多功能调控的p53不同，Perp主要聚焦凋亡信号通路，不影响T细胞体外分化与基础增殖。
5.研究意义与未来探索方向
本研究明确Perp缺陷会破坏胸腺阴性选择，增龄后易诱发自身免疫病。未来可通过基因回补实验进一步验证其作用靶点价值，同时探究自身免疫病患者Perp表达下调机制，有望将Perp开发为自身免疫病潜在治疗靶点。
参考文献：Zhou Y, Li J, Leng X, Shi J, Zhang G, Chen S, Liu D, Deng Q, He Y, Shi G, Xu Y, Liu Y, Wang Y. Perp Deficiency Induces Defective Negative Selection and Autoimmune Arthritis in Aged Mice. Aging Cell. 2026 May;25(5):e70514. doi: 10.1111/acel.70514. PMID: 42023717; PMCID: PMC13104118.
艾沐蒽专注于免疫驱动医学领域多年，开发的ImmuHub®技术平台方法全面，检测物种多样，建库方法具有灵活性，致力于为各大高校、医院、科研机构、企业等提供优良的科研服务。
ImmuHub®部分科研方向
ImmuHub®适用基因座
部分数据分析结果展示
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业和专精特新企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® 免疫力测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、新抗原、TCR和抗体发现等平台管线。目前为止发表了60余篇论文，其中包括：The New England Journal of Medicine(IF:158.5), The Lancet(IF:98.4), Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。
