艾沐蒽ImmuHub®免疫组测序平台灵活度极高，可以DNA或RNA作为模板，搭配不同的文库构建方法来实现免疫组测序，帮助您解读适应性免疫系统的复杂性。
关于如何选择RNA还是DNA，以及建库方法，很多老师初次接触免疫组测序技术研究时都会产生疑问，这重点取决于样本情况和相关研究目的。
本篇将重点介绍如何选择适合免疫组研究的技术方法以及选择的原因。
RNA VS DNA
尽管基因组DNA和RNA均可用于Immune Profiling，但每个细胞的mRNA拷贝数至少比gDNA多10到100倍。研究表明，较高数量的起始RNA模板拷贝可显著提高T细胞受体的检测水平。
由此数据可看到，相同样本基于mRNA的TCR测序结果，其TCR克隆型种类更多。（数据来源于Cellecta, Inc.）
2.基于RNA免疫组受体测序均是功能性蛋白序列，与抗原诱导和疾病特异性相关较高
图2. TCR DNA剪切转录、翻译过程
3.基于mRNA的免疫组测序能区分C区Ig亚型信息
图3. DNA层面VDJC连接示意图
4.基于mRNA的免疫组扩增，可获得VDJ全长信息
Bulk免疫组测序，使用mRNA结合5’RACE单对引物方法建库（建库方法介绍详细见后），可获得VDJ全长信息，而DNA层面不能（详见图12所示）。
单细胞VDJ测序也都是基于mRNA水平开展，同时能获得全长配对信息，也能联合转录组进行联合分析。
5.基于RNA层面开展的免疫组临床诊断和治疗转化应用更多
图4. 参考来源：Jingjing He ,etal. Defined tumor antigen-specific T cells potentiate personalized
TCR-T cell therapy and prediction of immunotherapy response
一个gDNA的拷贝对应一个细胞，适合于需要进行相对定量的检测，如血液肿瘤微小残留病检测（MRD）应用，具体应用可参考艾沐蒽Seq-MRD®相关介绍。(点击“阅读原文”，了解更多有关Seq-MRD®)
适用于一些不便提取RNA，仅能提取DNA的样本，如FFPE等。DNA保存相对稳定，不需要逆转录，技术要求低。
综上，除非对于应用于相对定量时需要使用DNA作为模板，其它情况，如疾病抗原相关的免疫组、biomarker应用、TCR-T免疫治疗开发等应用，建议首选均以RNA为模板来进行。
多重 PCR VS 5′RACE
基于5’RACE原理，引入UMB（Unique Molecular Barcode，独立分子条形码）进行文库构建。每个样本检测中，在原始RNA模板扩增前加入的UMB种类可高达约1700万种。这可对后续PCR扩增或测序过程中的错误进行有效纠正，还原真实的数据，有如下两个优势：
图8. 基于UMB的纠错
▲ 图9. UMB技术修正了PCR扩增和测序错误，还原真实的免疫组多样性（蓝bar），避免了假高多样性（红bar）
通过计数每种UMB的数目，对具有相同UMB的序列进行合并处理，可以将因为PCR扩增导致的多条相同序列，还原到样本PCR扩增前的真实状态，从而能够准确评估单克隆T细胞的比例。（单克隆T细胞比例是指测序仅测到一个TCR分子的比例，有研究表明这与初始T细胞成正相关）
对于扩增的全长序列，可以选择使用PE150测序仅分析CDR3区信息，也可使用PE300测序直接分析得到VDJ全长信息。
单细胞测序是采用 5’接头的通用引物和TCR/BCR恒定区(C 区) 的保守引物进行的进行巢式PCR，实现高特异性 TCR/BCR 的V区 (包含 V、D、J片段) 序列富集。扩增富集得到的全长V(D)J序列大概是650bp左右，通过酶切为长短不一的片段，再使用PE150测序。
部分基于ImmuHub®平台发表的学术论文：www.immuquad.com/publications
更多关于bulk免疫组测序与单细胞VDJ测序区别和如何选择，请关注艾沐蒽公众号下次分享。
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国内前沿的专注于免疫基因组学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子（纳斯达克代码：GTH）使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® |T细胞免疫测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®疾病早筛、单细胞测序、TCR-T药物开发等平台管线。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。
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