T细胞免疫组库全长测序 TR-Seq

ImmuHub®

为您提供灵敏、准确、全面的T细胞免疫组库(TCR)测序
ImmuHub®通过基于第二代高通量基因测序技术为血液、骨髓或组织样本提供非常全面的 TcR 测序分析。我们会对测序后数据进行详细得生物信息学处理及数据分析,并且能保证每个样本的测序过程和分析结果在整个实验中的一致性,最大程度得减少实验结果误差。

T 细胞属于人体免疫细胞,它在肿瘤免疫治疗,自身免疫疾病以及移植耐受等方面发挥着重要的作用。每个 T 细胞都有自己特殊的 T 细胞受体 (TcR),就像每一个细胞的身份证。对TcR测序分析可以准确监测我们免疫系统对疾病和治疗的反应,可以帮助科研者了解疾病与免疫系统的相互作用。

TcR 作用是识别抗原。T 细胞通过细胞表面的 TcR 来识别抗原呈递细胞带来的抗原,每一个 T 细胞含有一个特异的 TcR 用来识别相对特异的抗原。T 细胞通过 TcR 基因的重组从而达到其多样化 (Diversity) 的特点(如下图),并可识别各种抗原与之反应。

T 细胞受体是由α链和β链组成的(如图)。TcR 转录子是通过基因组里的α链或β链上的 V,(D),J 基因随机排序出来的。抗原主要结合的区域叫 CDR3 (Complementarity Determining Region 3),TcR 会经常出现核苷酸随机重组,所以每个人的 T 细胞受体就会有很高的多样性,这样就造成了 T 细胞受体的种类理论上会高达 1018 种。所以对健康的人和病人的 T 细胞受体测序是做好预防医学和个性化治疗的基础。

Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al.

ImmuHub®的技术优势

更少实验误差,更全面准确的分析

• 基于 RNA 的分析检测,这样除去了内含子,避免了不必要的引物及消耗和结果误差,获得的数据是基于表达的(有功能的)T、B细胞受体;
• 单对引物(5‘RACE)方法文库构建准确率高,测序数据与IMGT ® 数据库基因座匹配正确率可达97%-99.7%,并能扩增TCR和BCR的V-(D)-J 序列全长(包括 FR1-4 和 CDR1-3);
• 深度测序并使用世界领先生物信息学分析算法对数据进行处理,可进行下机数据全自动生信分析(无人值守)及纠错,纠正PCR和测序引入的错误,有更强的纠错能力和错配处理能力,更大程度的获得有效数据,挖掘测序获得的有效信息;
• 自主研发PCR反应体系稳定,接头序列连接效率高、目标基因扩增效率高;扩增灵敏度极高,RNA模板量最小化,最低可达10ng,为小或珍惜临床样本(如肿瘤病人骨髓或穿刺样本)获得测序可能性;
• BCR文库构建使用的优化引物可有效鉴别更多IGH链亚型,如IgA1, IgA2,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,IgE,IgM等;
• 相对多重PCR技术,可以完全避免引物偏好性。

提取样本 RNA

我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的T细胞亚型的 RNA,RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用,我们的每一步都会通过先进的设备,如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.),对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好,我们不会进行下一步,我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

cDNA 合成和文库构建

我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的T细胞亚型的 RNA,RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用,我们的每一步都会通过先进的设备,如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.),对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好,我们不会进行下一步,我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

单对引物(5'RACE)文库构建技术示例

基于UMB的超强纠错​

在原始RNA模板扩增前加入UMB(Unique Molecular Barcode,独立分子条形码)进行文库构建,可对后续PCR反应或测序过程中的错误进行有效纠正,还原真实的数据,完全杜绝PCR错误和测序错误,从而提高准确率。 模拟无PCR化测序,还原PCR之前的真实分子数量。

保留突变信息,纠正测序错误信息

高通量测序

我们可使用 MiSeq® (Illumina Inc.) 2 × 300 bp pair-end 方法来对 TcR 进行测序,保证 TcR 的全长序列都可获得。亦可使用HiSeq®  X10以获得更大的通量和更便宜的价格。

数据分析

TcR 的测序数据将通过我们世界领先的生物信息学分析算法进行处理

Figure Samples

ImmuHub®的测序服务步骤

服务流程:客户提供样本,通常为全血、骨髓、单个核细胞、分离后的T细胞、RNA/cDNA或者石蜡包埋的组织[FFPE],送达公司实验室后,实验室根据样本的情况,进行血液或骨髓的T细胞分离→ RNA 提取→ cDNA 合成→测序文库构建第二代基因测序→生物信息学处理→数据分析和出图→临床信息分析(如下图)。 45个工作日后客户获得测序结果报告。

标准分析(免费)

1.CDR3克隆鉴定、计数、频率
2.克隆性指数和多样性指数
3.CDR3核酸序列长度
4.气泡图
5.V/D/J基因频率分布柱状图
6.V/D/J/基因频率分布饼状图
7.V-J基因片段组合circos图
8.V-J基因片段组合使用森林图
9.V-J基因片段组合使用热力图
10.克隆频率分类呈现蜗牛图
11.全长克隆序列分析

深度分析(收费)

1. V-J基因片段组合
(1)V-J基因组合频率差异分析
(2)显著性差异V-J基因组合箱线图
2. V/D/J基因片段使用频率
(1)V/D/J基因使用频率heatmap图
(2)V/J基因使用频率丰度差异分析
(3)显著性差异V/J基因的使用频率箱线图
(4)V/J克隆频率Tree-map图
3. 两个(或多个)样本共享克隆统计分级
(1)共享克隆和独有克隆的频率点状图
(2)共享克隆频率追踪图
(3)多样本间独有及共享克隆分布文氏图和多维venn图
4.Top克隆在多个样本中的追踪分析
(1)热力学追踪图
(2)多样本间的克隆追踪堆积图
5. 两个或多个样本、组间的克隆性变化、多样性指数比较
6.比较多组样本中每组样本相似度计算——统计各样本间的MOI值
7.样本间V-J使用情况主成分分析(PCA)
8.不同样本的Top N克隆分类频率分布图
9. 多个样本CDR3 Motif、Gliph分析
10. 各样本间CDR3序列Logo图
11. 多样本间的CDR3基因的Cytocape分析。
12.Top100克隆Levenshtein聚类图
13.CDR3 AA序列的理化特性的聚类分析
14. BCR特有分析
(1)B细胞同型转换频率组间箱线图
(2)体细胞超突变频率散点图
(3)抗体序列系统发育树分析

其他个性化分析依据需求难度收费
由客户明确提供需要的具体分析和图示以及附上参考文献。


【1.】 T细胞受体基因的专业术语起初是两个字母——“TR”,由国际人类基因命名委员会(HGNC)1999年审核通过。因而当提及到基因、基因座和链时,TR应该是最准确的描述。不过TcR是目前用得最广泛的。但是,大写的 ”TCR“ 缩写混淆了基因命名,应该避免。