免疫组库选择DNA还是RNA起始?如何选择建库策略?

人体的适应性免疫系统主要依靠于T淋巴细胞和B淋巴细胞表面的T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)上的互补决定区(CDR)与MHC-抗原肽分子进行识别并特异性结合。大量研究表明对BCR或TCR进行测序可用于诊断B或T淋巴细胞恶性肿瘤及追踪治疗后效果。


因此,对免疫组库进行测序以及长期监测是疾病早期发现、诊断以及疗效预测评估的重要方法

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什么是免疫组库


在人类的免疫系统中T细胞受体和B细胞受体的序列具有巨大的多样性,这种多样性的存在使人体的免疫系统能够针对多种病原进行免疫反应以起到广泛保护人体的作用。因此免疫组库(Immune Repertoire,IR)是指在任何指定时间,个体的循环系统内所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。


通过分析免疫组库里决定B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)多样性的互补决定区(CDR区),全面评估免疫系统的多样性,深入挖掘免疫组库与疾病的关系。



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如何正确分析免疫组库


传统的测序方法诸如克隆、桑格测序和抗原特异性功能验证测序,因为通量较低,针对TCR和BCR谱系的研究内容并不全面。而随着高通量测序技术的开发和发展,打破了之前低通量对免疫组库研究的限制,使得从巨大的T/B细胞库里寻找抗原特异性T/B细胞成为可能。不过要得到理想的免疫组库分析结果,还得掌握正确的“打开方式”。


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选择DNA还是RNA起始


每个细胞仅一条DNA模板,理论上以DNA起始更容易确定克隆型的相对丰度。但是,每个细胞可能有多拷贝的TCR或者BCR转录本,因此以RNA为模板会更灵敏,对特定的受体变体分析更完整,包括稀有表达的受体。此外,mRNA测序分析的是已表达并经剪切、转录后加工的受体序列,更容易获得功能蛋白信息。相反,基于DNA的方法会得到大量与功能无关的序列信息。


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选择VDJ全长序列还是CDR3区


一些科研人员只关注TCR或者BCR序列的CDR3区域(互补决定区3),这是由于CDR3区包含抗原-受体作用的核心位点,也是变化最多的区域。

然而,全长测序能提供受体序列额外的区域信息,包括CDR1和CDR2。这些区域参与抗原-受体结合的亲和性、下游信号传递。另外,获得的全长序列还可应用于克隆实验,对抗体及T细胞治疗的研发尤为重要。


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选择合适的建库方法


传统的免疫组库测序,使用的是多重PCR或者RACE的方法进行扩增和建库,这也是目前国际上通用的两种方法。目前,艾沐恩ImmuHub®免疫组文库构建平台根据样本情况和研究目的使用的正是这两种技术路线:

1. 多重PCR引物建库:以DNA为模板,针对CDR3区设计多对引物,扩增出CDR3区段,再进行文库构建并测序。


2. 5’RACE单对引物建库:以mRNA为模板,在恒定区设计引物逆转录扩出TCR或BCR的全长序列,再进行文库构建并测序。

▲ 图1. ImmuHub®技术路线

艾沐蒽可根据不同样本类型和研究需求为客户提供个性化的文库构建和测序模式,通常使用5’RACE或多重PCR文库构建方法。如果符合RNA提取条件,一般首选推荐RNA+5’RACE方法。


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RNA+5’RACE建库方法优势

[1]  引入UMB技术,杜绝PCR扩增和测序错误

基于5’RACE原理,引入UMB(Unique Molecular Barcode,独立分子条形码)进行文库构建。每个样本检测中,在原始RNA模板扩增前加入的UMB种类可高达约1700万种(图2),这可对后续PCR扩增或测序过程中的错误进行有效纠正,还原真实的数据,有效杜绝PCR扩增错误和测序错误,从而提高结果准确率

▲ 图2. 基于UMB的纠错

引入UMB技术有两个优势:
(1)通过将具有相同UMB的reads聚集在一起可以有效矫正PCR扩增和测序错误,避免由于实验误差产生的新序列,解决了假高多样性(图3);

▲ 图3. UMB技术修正了PCR扩增和测序错误,还原真实的免疫组多样性(蓝bar),避免了假高多样性(红bar)
(2)通过计数每种UMB的数目可以还原PCR扩增前的真实RNA序列比例,更真实地反应样本单克隆T/B细胞的情况(图4)。

▲ 图4. UMB技术消除PCR扩增序列,还原了PCR扩增前的真实单克隆T/B细胞比例(蜗牛图中1的部分)

[2]  减少PCR扩增偏好性

多重PCR引物建库法使用一组与已知V基因互补的正向引物和一组与J或C区域互补的反向引物。此种方法因同时进行几十对引物的扩增,体系异常复杂,且多种引物扩增效率可能存在偏倚,难以等效扩增,即使再优化调整,也无法和单对引物的等效扩增相比。因为5’RACE单对引物建库因仅采用一对引物进行扩增,可有效减少PCR扩增偏好性。在某些样本中,用多重PCR引物扩增方法,就极容易扩增出来某一种的V基因片段,表现为样本中频率最高的V基因片段都相同(图5下),而用5’RACE的方法可以看到这些不同样本中频率最大的V基因片段都是不同的(图5上)。

▲ 图5. 引物偏好性

[3]  可扩增出VDJ全长信息

5’RACE单对引物建库法能够得到包含完整TCR/BCR,这意味着可以保留完整的V基因序列,即可以扩增VDJ全长序列,同时又由于是根据C区设计引物,还可得到C基因信息,如对BCR测序,还可得到IgH isotype信息。此种方法能够匹配多种不同测序模式,PE150/PE250/PE300均可。而多重PCR方法仅能扩增CDR3区。

▲ 图6. 5’RACE单对引物建库与多重PCR引物建库扩增区域

综上,ImmuHub®免疫组测序技术平台是非常灵活的一个文库构建平台,能根据样本情况和研究目的匹配。当能同时提取RNA或DNA时,我们首选使用RNA+5-race方法建库后,再进行高通量测序可获得更为准确和全面的TCR/BCR信息。

▲ 图7. ImmuHub®技术方法与优势

部分基于ImmuHub®平台发表的学术论文:www.immuquad.com/publications

随着免疫组库测序技术越来越成熟,其在血液肿瘤MRD监测、疾病早期诊断、免疫重建评估等方面发挥了越来越重要的作用。免疫组测序将会应用更多的方向,将更多不可能化为可能。我们认为,将会有更多有趣的生物学发现会被报道、生物学解释会被证实。更多关于免疫组测序科研应用方向请点击TCR/BCR免疫组可测序与应用方向

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关于艾沐蒽


杭州艾沐蒽生物科技有限公司由美国芝加哥大学科研团队回国创办,是一家专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗,并致力于推进免疫驱动医学领域发展的国家高新技术企业。艾沐蒽站在适应性免疫系统研究的最前沿,自主研发的免疫医学平台可揭示和翻译适应性免疫系统的遗传密码,并能应用于癌症、自身免疫性疾病、传染性疾病等免疫介导性疾病的诊断、监测和治疗中。



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