一、CAR-T疗法
CAR-T细胞疗法是一种基于人工修饰的T细胞治疗，可以通过CAR（chimeric antigen receptor）分子靶向识别肿瘤细胞表面抗原，进而杀伤癌细胞。
Fig. CAR-T 细胞免疫疗法原理示意图
目前，CAR-T在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤治疗中得到广泛应用，但是CAR-T细胞治疗的反应率和持续性仍然存在挑战。
T细胞受体（TCR）测序能够有效地评估CAR-T细胞的特征，持续追踪回输体内后的变化。为了提高CAR-T细胞治疗的疗效和安全性，使用免疫组TCR NGS技术已经被广泛地应用于CAR-T细胞治疗中，同时免疫组Ig NGS技术能有效评估CAR-T治疗后的微小残留病（MRD）水平。 本文将综合介绍免疫组库高通量测序技术如何助力CAR-T细胞治疗在B系血液癌症中的开发和监测。
二、TCR测序助力CAR-T研发和伴随监控 T细胞免疫组库测序以T细胞为研究目标，艾沐蒽基于ImmuHub®技术平台，扩增TCR β链 VDJ重排基因全序列，再进行高通量测序，从而评估T细胞克隆构成和多样性。近年来，TCR测序被广泛应用在CAR-T细胞治疗领域。
1、CAR-T细胞的克隆性检测和持久性检测 ①CAR-T细胞的克隆性检测 FDA草案中提及临床前先需评估CAR-T的TCR克隆构成和克隆性，以防止不受控制的增殖和毒性。关于CAR-T产品的质控是非常重要的环节。
CAR-T功能性检测方法主要检测CAR-T细胞的生物学功能，包括细胞杀伤活性、细胞因子释放、细胞迁移能力等，常用的方法包括细胞杀伤实验、ELISA等。而这些方法不足以评估CAR-T细胞中的T细胞受体特点，TCR克隆性和多样性能反映CAR-T细胞制备过程中的克隆构成和功能，进而评估CAR-T细胞产品的质量和功能。
克隆性指的是CAR-T细胞中克隆的程度，TCR克隆度过高会导致免疫失调和克隆性疾病的发生；TCR多样性则指CAR-T细胞中的T细胞受体（TCR）序列的多样性，多样性越高，CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的效果越好。 数据展示 Fig. TCRVβ distribution in CD8− (left) and CD8+ (right) CAR T cells in the cellular infusion product of Patient-10.
Fig. Frequency of TCRVβ gene segment usage in the blood of Patient-10 one month (left) and two months (middle) after the second CAR T cell infusion. Joseph, F. et al.在Nature上发表相关成果，数据表明通过TCR NGS测序对 CAR-T细胞产品检测克隆构成，TCRVβ具有高度多样性，输注后CAR-T TCRVβ5.1克隆高度增殖并持久存在从而对抗肿瘤。
以上说明，通过对CAR-T细胞中的T细胞受体（TCR）进行测序分析，可以确定CAR-T细胞的克隆构成和多样性，这可以为CAR-T治疗的监测和预后评估提供重要信息。此外，TCR测序还可以用于检测CAR-T细胞的增殖和生存能力，以及CAR-T细胞与肿瘤细胞的相互作用模式。通过对TCR测序数据的分析，可以帮助优化CAR-T治疗的设计和优化CAR-T细胞的生产过程，以提高CAR-T治疗的疗效和安全性。 ②CAR-T回输后持久性检测 FDA建议监测含有整合转基因的CAR – T细胞的持久性。常用方法如：使用流式的CAR表达检测，基于PCR的载体拷贝数检测，基于NGS的整合位点分析，这些方法虽然可以提供可靠和可重复的数据以确保结果的准确性，但TCR测序方法相比这些，可以不受限于活细胞，检测的灵敏度要更高，能定量检测到工程化的T细胞克隆。
TCR测序可用于对CAR-T治疗后患者的外周血和骨髓样本进行检测，以评估CAR-T细胞在体内的持久性和扩增情况（Alyssa, S. et al.）。
具体来说，通过对患者外周血和骨髓中T细胞的TCR进行测序，可以鉴定出CAR-T细胞的TCR序列，并进行定量分析，以确定CAR-T细胞的扩增和生存情况。此外，TCR测序可以发现治疗后出现的新的T细胞克隆或者克隆组成的变化，这些变化可能与治疗疗效、疾病复发和预后密切相关。 数据展示 Fig.Clonal diversity of CD8+ CAR-T cells decreases after infusion. 如上数据表明，CAR-T细胞在体内存在多种克隆，并且克隆组成在不同时间点和不同患者之间存在差异，这表明CAR-T细胞克隆的动力学是复杂的，可能与患者的个体差异、治疗方案和CAR-T细胞的质量等因素有关。
在CAR-T治疗后的早期阶段，CAR-T细胞的扩增速度很快，但是在治疗后的后期阶段，CAR-T细胞的扩增速度逐渐减慢，并且克隆组成开始发生变化。
在CAR-T治疗后的不同时间点，CAR-T细胞克隆的多样性和均匀性存在差异。在治疗后的早期阶段，CAR-T细胞克隆的多样性和均匀性较高，但是在治疗后的后期阶段，CAR-T细胞克隆的多样性和均匀性逐渐降低。
2、Immun-Traq® 评估CAR-T输注前后的治疗效果 Immun-Traq®是基于艾沐蒽自主研发的专利技术Immuhub®平台TCR NGS技术来动态监测追踪患者治疗前和后的TCR多样性和克隆性情况，进而对免疫系统状况进行评估，以及预测和评估治疗效果。 数据展示 Fig. Clonal proliferation of T cells was detected post-infusion. a A representative donut chart of the blood sample from patient 2 displays the clonal expansion after CAR-T transfer. Fig. The exclusive treatment-related T cell clones originated from pre-treatment autologous non-CAR T cell pool in peripheral blood. The representative graph of clone-tracking heat map from patient 2. 艾沐蒽通过TCR测序对中国B-ALL患者CAR-T治疗前和治疗后多个时间点的外周血和骨髓样本进行研究（Wang X. et al.）。
研究结果表明，CAR-T细胞疗法对TCR的克隆性和多样性有巨大影响，治疗后会出现明显的T细胞克隆性增殖，提示CAR-T细胞对肿瘤的杀伤会使更多的癌细胞抗原释放，可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的克隆性增殖。结果发现患者肿瘤抗原特异性T细胞来自患者自身体内，而非来自CAR-T细胞。提示CAR-T回输后，对肿瘤杀伤引起癌细胞抗原释放，引起体内肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，从而起到更大的肿瘤细胞杀伤效应。
文章揭示了CAR-T疗法可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，并且这些T细胞克隆的出现是随着癌细胞的凋亡而出现的，提示它们最可能是肿瘤抗原特异性的T细胞。
艾沐蒽生物自主开发的Immun-Traq®技术平台在实验中证实能通过监测T细胞以及分析患者个体的整体免疫功能特征，来评估CAR-T治疗效果，从而更好地分析患者对于癌症免疫疗法的治疗反应，提早预测包括细胞免疫疗法在内的抗癌免疫疗效。
三、Seq-MRD®技术能追踪CAR-T治疗后的MRD水平 目前，CAR-T治疗已显示出良好的疗效，然而CAR-T细胞治疗后仍然存在高复发率，传统技术的微小残留病（MRD）监测无法准确量化疾病负担，也无法进行高灵敏度的深度监测。尤其CAR-T治疗初期能为患者带来深度缓解，但流限于流式细胞术 (FC) 灵敏度，无法检测到MRD在10-4以下是否仍然存在肿瘤克隆，这就需要更高的灵敏度方法进行检测，进而为指导临床干预治疗参考。
Seq-MRD®基于NGS平台，通过特异性检测T或B淋巴细胞的T细胞受体（TCR）TRB/TRG基因或B细胞受体（BCR）IgH/K/L基因的CDR3区域序列，筛选出患者体内肿瘤细胞显著而特异性的克隆重排形式，可在治疗后对这些肿瘤细胞进行跟踪，即进行MRD的检测，从而为癌症幸存者后续治疗方案提供参考。
Seq-MRD®检测优势如下： [1]灵敏度高达10-6 [2]特异性高，可避免由新的抗体靶向治疗方式和癌细胞突变所引起的检测误差 [3]追踪新克隆发现克隆演变，给予患者更可靠的检测结果 [4]增加对CLL/SLL的IGHV突变检测的Seq-SHM®功能
数据表明，FC检测所有患者的 MRD结果均为阴性，而Seq-MRD®能检测到CAR-T治疗后MRD 水平 > 0.01%患者的 LFS 和 OS 均低于MRD ＜ 0.01% 的患者。说明Seq-MRD®相比FC，更适合应用于CAR-T治疗的MRD检测，能更准确预测患者预后（Figure b&c）。
结果表明，经过CAR-T治疗后的MRD水平较低，FC不易检测到。而Seq-MRD®能持续动态监测到CAR-T输注后的MRD水平变化，根据Seq-MRD®结果提示临床可以进行早期干预。 四、检测流程 对于CAR-T治疗后的CAR-T持久性评估，治疗后效果评估，免疫重建水平的监控非常重要。 艾沐蒽结合自身产品，包括Seq-MRD®，Immun-Traq®，和ImmuHub®的技术优势，整合了一套专为CAR-T的研发和监控的伴随解决方案。 CAR-T研发和伴随监控解决方案检测流程
在CAR-T研发中，本解决方案可以用来检测CAR-T细胞的克隆性和持久性，可以帮助优化CAR-T治疗的设计和优化CAR-T细胞的生产过程，以提高CAR-T治疗的疗效和安全性；同时通过Seq-MRD®检测评估CAR-T治疗后MRD水平，帮助研究人员评估CAR-T疗效，并且在治疗后的随访过程中评估免疫系统的重建情况；并可以动态追踪CAR-T持久性情况，可以帮助研究人员了解疗法的效果，更好地评估疗效，并有效地监控治疗后的情况。 五、送检要求
Immun-Traq®部分参考文献: [1]Wang, X. et al. Quantitative characterization of T-cell repertoire alteration in Chinese patients with B-cell acute lymphocyte leukemia after CAR-T therapy. Bone Marrow Transplantation (2019). https://www.nature.com/articles/s41409-019-0625-y
Seq-MRD®部分参考文献: [1]Huang, Y. et al. Predictive value of next-generation sequencing-based minimal residual disease after CAR-T cell therapy. BMT (2022). https://www.nature.com/articles/s41409-022-01699-2
ImmuHub®技术平台参考文献:
其它部分参考文献: [1]Joseph, F. et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.Nature(2018). https://www.nature.com/articles/s41586-018-0178-z [2]Alyssa, S. et al. Clonal kinetics and single-cell transcriptional profiling of CAR-T cells in patients undergoing CD19 CAR-T immunotherapy. Naturecommunications(2020). https://www.nature.com/articles/s41467-019-13880-1
