2025年5月5日，在一场聚焦血液肿瘤精准医疗的国际学术交流活动中，艾沐蒽团队与西班牙纳瓦拉大学 Bruno Paiva 教授就多发性骨髓瘤（MM）的微小残留病（MRD）检测方法与临床治疗效果等前沿话题展开了深入且富有成效的交流。
在MM中，使用大剂量治疗后进行自体或异体造血干细胞移植（HSCT）能够实现更高的CR率，从而促使了在适合移植的患者中对MRD进行研究，以表征CR的质量，用于预测预后（图1）。最初，MRD评估依赖于低敏感性的技术如三色或四色流式细胞术，其检测限约为10-4。随着高剂量疗法及自体造血干细胞移植（HDT/ASCT）的引入，完全缓解率显著提高，促使了对适合移植患者的MRD进行更深入的调查，以更好地描述完全缓解的质量并用于预后判断。进入21世纪，免疫调节药物和蛋白酶体抑制剂的应用进一步提升了完全缓解率，推动了MRD研究在不适合移植患者中的扩展。过去的几十年，随着新型治疗方法如抗CD38单克隆抗体、抗BCMA抗体-药物偶联物以及靶向BCMA的CAR-T细胞等的发展，MRD检测技术也得到了革新，特别是下一代流式细胞术（NGF）和下一代测序（NGS），这些技术能够实现≤10-5的检测限，在超过90%的样本中达到无法检测的MRD水平。
图1
当前的趋势是利用这些高灵敏度的MRD检测方法作为加速治疗批准的终点之一，并且越来越多的研究表明，持久的MRD阴性状态与MM患者生存期延长显著相关（表1）。
MM中MRD检测的方法
基于NGS的MRD检测通过识别和定量免疫球蛋白重链和轻链基因重排来追踪残留肿瘤细胞。检测前需采集高肿瘤负荷样本以确定克隆特异性序列，用于后续监测。约95%的患者在治疗前可获得明确的克隆序列。开发NGS为基础的检测方法是为了克服传统PCR方法的应用局限，如较低的适用性，并实现了几乎在所有样本中的高灵敏度（可达10-5或更高）。此外，美国FDA已批准clonoSEQ NGS检测用于B细胞恶性肿瘤（包括多发性骨髓瘤）的MRD评估。NGS的一个重要优势在于它既可以使用新鲜样本也可以使用冻存样本进行分析，使其成为大规模、国际或多中心临床试验中MRD分析的理想选择。这些研究依赖于样本存储和批量处理，而高质量、标准化的MRD数据的生成对MRD阴性作为早期试验终点的认可至关重要，该终点支持新疗法加速审批过程中的应用。
流式细胞术（Flow Cytometry）是最早用于微小残留病灶（MRD）评估的技术之一，并一直沿用至今。随着技术的发展，该方法从早期的DNA倍体分析和三色或四色荧光标记，逐步演进为使用六色、八色甚至十色抗体组合的多参数免疫表型分析，同时伴随着仪器与试剂的不断优化。尽管PCR和NGS在灵敏度方面通常优于传统的少色流式检测方法，但新一代的标准化流式技术——如EuroFlow联盟开发的八色两管“标准化下一代流式（NGF）”方法，已将灵敏度提升至 2×10-6，与NGS相当，具备了在临床试验和常规实践中广泛应用的潜力，并正在推进监管审批。其优势：
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检测周期短（约24小时）；
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可评估骨髓稀释程度，避免因样本不具代表性而导致的假阴性结果；
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无需治疗前样本即可识别异常表型的克隆性浆细胞，提高了实用性。
外周残留疾病的分析
MRD（微小残留病灶）动态变化对多发性骨髓瘤（MM）患者的生存结局具有明确且显著的影响。尽管持续的MRD缓解状态在逻辑上被认为具有重要意义，由于早期的研究仅限于进行一到两次的MRD评估，所以其价值直到近期才被正式确立。目前发现，与最有意义的变化是在维持治疗期间（例如从MRD无法检测状态转变为可检测状态）。这表明与传统的疗效评估标准类似，MRD也需要定期监测，才能更准确地预测患者的生存结果。在临床试验中，频繁的MRD检测已成为常规；但在日常临床实践中，由于需要反复进行骨髓穿刺，尤其对于年老体弱的患者而言，这种方式往往带来不适。因此，人们越来越关注通过较微创的方式在外周血中评估残留疾病。外周血中的残留疾病在生物学和临床意义上可能与骨髓中的MRD有所不同，因此应予以区分，并被称为“PRD”。
基于检测克隆型V(D)J重排或体细胞突变，外周血DNA的NGS可用于来监测PRD，可反映CTCs和/或骨髓瘤细胞来源的循环游离DNA（cfDNA）的存在。在一项多中心、前瞻性、观察性研究中，研究人员评估了在接受Ixazomib（伊沙佐米）、来那度胺和地塞米松联合治疗的复发/难治性多发性骨髓瘤（RRMM）患者中，使用cfDNA的NGS监测与MM常见相关基因突变的价值。研究发现，在单因素分析中识别出的六个最关键基因（KRAS、TP53、DIS3、BRAF、NRAS和ATM）中所检测到的突变总数，与较差的无进展生存期（PFS）显著相关：未检测到突变、1个突变、以及2个及以上突变患者的2年PFS分别为57.3%、22.7%和0%，这一预后差异独立于临床因素和cfDNA浓度。然而，尚不清楚在一线治疗中（残留疾病负担通常较低）是否能通过该方法获得相同的预后价值。
挑战和机遇
对于多发性骨髓瘤（MM）患者，持续存在微小残留病灶（MRD）而外周血中无法检测到可测量残留疾病（PRD）的情况，其无进展生存期（PFS）较双阴性结果的患者更差。这意味着在骨髓中持续存在MRD的患者中，约20%-30%可能会出现假阴性的PRD结果。
1.挑战
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假阴性结果：当前技术条件下，对于那些在骨髓中仍能检测到MRD的患者，如果仅依赖于PRD检测，则可能导致错误的安全感，因为这些患者的预后实际上并不乐观。
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检测灵敏度：为了减少假阴性PRD结果的发生，需要开发更加敏感的方法来监测外周血中的残留疾病。
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样本类型的选择：尽管骨髓穿刺是目前评估疗效的金标准，但这种方法对患者来说较为繁琐且不适，特别是在治疗的早期或强化阶段。
2.机遇
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更敏感的技术：随着如通过BloodFlow进行的循环肿瘤细胞（CTC）分析、多模式PRD评估（例如NGF或BloodFlow联合质谱检测）的发展，以及对其他循环肿瘤生物标志物（包括可溶性BCMA）的研究，有望显著提高PRD检测的准确性，减少假阴性结果的发生。
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动态监测的可能性：PRD评估可能使MM治疗疗效的监测变得更加动态和不那么繁琐，尤其是在维持治疗期间或观察期内，可以通过更频繁的PRD检测部分替代骨髓穿刺。
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早期干预的机会：研究表明，在骨髓中检测到MRD的患者中，若同时在外周血中发现PRD，这可能是即将发生疾病进展的一个预警信号。因此，在考虑对这类患者进行早期干预时，进一步探索PRD的生物学意义显得尤为重要。
MRD和PRD检测的算法
鉴于适合移植的NDMM患者的新标准治疗方案的4年PFS约为85%，中位PFS可能达到10年或更久，理想情况的治疗应为固定期限，尤其是对于达到MRD持续无法检测且没有MRD转阳长期风险因素的患者。因此需要频繁进行MRD检测，然而，频繁进行MRD检测的实际操作存在挑战，特别是在长时间内难以频繁获取骨髓样本的情况下。因此，结合骨髓中的MRD评估与高灵敏度、动态和微创的外周血可测量残留疾病（PRD）评估显得尤为重要。为此，研究提出了一种评估算法：
在治疗的第一年内，以骨髓穿刺样本中的MRD评估作为标准方法，这符合当前用于支持新疗法加速审批的“MRD阴性完全缓解”终点。在治疗第一年内，由于大多数患者的MRD状态为阴性，PRD评估的价值相对有限，但可以考虑使用质谱法（MS），同时注意避免假阳性结果。
对于在治疗初期实现MRD阴性的患者，建议定期（例如，在首次MRD阴性结果后的每24个月）确认其MRD状态，，为了避免在较短时间内进行多次骨髓穿刺，建议每两年进行一次骨髓MRD评估并结合每6个月一次的外周血PRD评估（通过MS、NGF或NGS）。如果PRD持续阴性，则可能意味着MRD仍处于阴性状态；若PRD出现回升，则自动视为MRD阴性丧失的标志，无需再次骨髓穿刺确认。
当前和未来MRD疗效标准
目前严格完全缓解（sCR）的价值存在争议。2016年国际骨髓瘤工作组（IMWG）提出了关于响应和MRD评估的新标准，定义了参考方法及最低灵敏度阈值，使MRD评估标准化并成为临床试验的重要终点。此外，还制定了国际共识建议以规范MRD数据的评估和报告。最近，MRD阴性CR作为支持加速批准MM治疗的一个早期终点，强调了高质量标准化MRD数据的重要性。尽管更深的反应通常与更长的生存期相关，但在初治环境中，一些未达到CR但检测不到MRD的患者，其生存结果与MRD阴性CR患者相似。而在复发/难治性MM（RRMM）患者中，CR状态对生存结果的影响更为显著。因此，未来的响应标准应维持CR要求来定义MRD阴性，同时灵活地报告无论CR状态如何的MRD阴性响应率。
2016年IMWG共识标准中对MRD阴性反应的灵敏度要求常被误解。实际上，无论是流式细胞术还是测序方法，定义MRD阴性均要求在≥105个有核细胞中未检出克隆性浆细胞，即最低灵敏度为10-5，但这并不意味着只能使用该灵敏度，更高的灵敏度（如10-6）也可用于评估。
研究证据表明，在多发性骨髓瘤（MM）患者中，任何水平的持续MRD（即使低于10-5或10-6）都与较差的无进展生存期（PFS）相关。因此，从预后的角度看，未来在制定治疗决策时应使用最高可达的灵敏度（如NGF或NGS的10-6）来定义MRD无法检测。但临床试验中作为早期终点的MRD阴性CR仍需采用10-5阈值，因为它几乎适用于所有样本，便于各治疗组及研究之间的比较。
实施MRD评估时需注意以下实操要点：1. 需严格遵循IMWG标准，并按国际共识规范报告数据；2. 报告MRD阴性率时应以意向治疗人群为分母，并预设评估时间点以减少数据缺失；3. 使用首次骨髓穿刺样本以避免血液稀释导致的假阴性结果，且无论采用哪次骨髓样本，均需评估血液稀释程度，若样本严重稀释且MRD阴性则不应计入结果；4. MRD阴性应根据每份样本的检测限（LOD）定义，整体报告灵敏度需覆盖>90%的样本；5. MRD动态监测（如12或24个月持续阴性）比单次评估更具预后意义，应作为常规报告内容。
在随着过去20年中19种新药获批，多发性骨髓瘤（MM）患者的生存期显著延长，部分患者甚至有望实现长期缓解或潜在治愈。然而，临床试验也因此变得更加复杂：需要更大样本量、更长随访时间，才能观察到无进展生存期（PFS）或总生存期（OS）的显著改善。为加快有效治疗方案的研发并优先评估最有前景的方法，亟需一个可靠的早期替代终点。
微小残留病灶（MRD）阴性完全缓解（CR），即在达到传统CR标准的基础上，通过高灵敏度方法（灵敏度≥10⁻⁵）检测不到残留肿瘤细胞，已被多项大型荟萃分析证实与良好预后高度相关：
i2TEAMM研究分析了20项试验共12,926例患者数据，发现治疗前9–12个月内达到MRD阴性CR者，其无进展生存率比未达该状态者高出3–16倍。在试验层面，MRD阴性CR率与PFS之间具有较强相关性（R²=0.61–0.70），在新诊断MM（NDMM）人群尤为明显（R²=0.67–0.78）。
EVIDENCE研究对4907例NDMM患者进行分析，也显示出相似结果，其中12个月时MRD阴性与PFS个体水平的比值比为4.02；复发/难治性MM（RRMM）患者中这一比值比高达7.67。
FDA基于上述数据开展的综合分析也得出一致结论。
基于这些数据，FDA肿瘤药物咨询委员会（ODAC）于2024年4月12日全票通过将MRD阴性CR作为支持MM新疗法加速批准的中间终点。
MRD阴性CR不仅是一个强有力的预后指标，也正在成为评估新疗法疗效的重要临床试验终点。多项荟萃分析表明，在随机临床试验中，当治疗组间MRD阴性CR率差异达到或超过20%时，通常预示着无进展生存期（PFS）的显著改善（即PFS风险比。而对于未带来明显PFS获益的研究（风险比≥0.60），其MRD阴性CR率差异通常仅为2.5%左右。这一发现支持将MRD阴性CR率差异作为预测临床获益的重要参考。
对于单臂试验（如用于复发/难治性多发性骨髓瘤RRMM的试验），明确一个具有预测价值的cut-off值尤为关键，有助于判断治疗是否可能带来长期生存获益。此外，从实际操作角度看，使用MRD阴性CR作为终点可大幅度缩短试验周期。例如：一项典型的双臂NDMM试验若需最终分析331个PFS事件，需随访7至12年，而如果采用MRD阴性CR终点，可在入组完成后约12个月得出结果，整体数据截止时间约为3.7年，在理论上比PFS的中期分析提前>3年，比PFS的最终分析提前>8年，这不仅加速了有效疗法的开发进程，也为早期识别无效疗法提供依据，从而避免不必要的资源浪费和患者暴露于无效治疗。
此外,在OS终点因疾病进展后治疗交叉而被稀释的情况下，将MRD阴性CR与PFS设为共同主要终点，有助于更准确地判断一种新疗法是否可能带来生存获益。
尽管越来越多的研究支持微小残留病灶（MRD）评估在指导多发性骨髓瘤（MM）患者的治疗决策中的价值，但在日常实践中实施MRD评估仍面临多个挑战和争议。以下是五个主要的质疑点及其应对策略：
目前尚无明确指南说明如何根据MRD结果进行个性化治疗。然而，考虑到MRD是MM中最重要的预后因素之一，在达到完全缓解（CR）的患者中不评估其状态是不可想象的。正在进行的多项临床试验（如DRAMMATIC、GEM2017FIT等）正在探索MRD作为生物标志物或治疗分层工具，预计这些研究的结果将为日常实践提供关键指导。
频繁的骨髓穿刺可能对患者造成负担，但借鉴白血病领域的经验，适当的骨髓检查通常会被患者接受。建议在治疗初期至少每年进行一次MRD评估，并可根据个体情况进行调整。新一代检测方法，有望减少对频繁骨髓穿刺的需求。此外，可以预计PRD评估的逐步实施将改变对MM的监测方式。
在临床实践中，MRD阴性的患者生存结局通常不如临床试验中的患者，这反映了两种环境之间治疗方案和方法学上的差异。应在日常实践中应用国际骨髓瘤工作组（IMWG）的MRD评估共识标准，以确保最佳结果。
尽管MRD无法检测并不意味着治愈，但它反映了肿瘤生物学的整体情况及对治疗的敏感性。对于达到CR的患者，通过MRD反应和动态变化来更好地理解后续治疗效果是评估MRD的重要理由。深度和持续的MRD反应可能是部分患者安全停止治疗的生物标志物。
尽管有些持续存在MRD的患者可以有较长的生存期，但这不应掩盖大多数患者疾病进展风险增加的事实。诊断时的新生物标志物（如MGUS样特征和不可检测的CTCs）以及MRD评估时的生物标志物（如增强的非恶性浆细胞恢复）有助于识别可能有良好结局的MRD阳性患者。此外，MRD动态变化也可能帮助区分不同生存结局的患者群体。
在MM患者中评估治疗反应主要有三个目标：（1）识别对治疗原发耐药的患者，这些患者疾病进展和生存预后较差的风险极高；（2）根据治疗反应的深度进一步细化患者的预后判断；（3）在临床试验中比较不同疗法的有效性。由于当前治疗方案所带来的完全缓解（CR）率非常高，持续存在的微小残留病灶（MRD）很可能会取代M蛋白的检测，成为原发耐药的一个生物标志物。实际上，MRD状态是MM患者最强大的预后因素之一，甚至是最强大的预后因素，其在临床试验中的应用作为终点指标正在迅速扩展。此外，许多研究正在探索MRD在个性化治疗方案中的作用。这些研究结果的公布将有助于更好地了解MRD如何改善患者预后和QOL，而MRD和PRD评估的结合可能是实现这一目标的关键。
在探索如何更好地利用MRD来改善多发性骨髓瘤（MM）患者的治疗结局和生活质量的过程中，选择高效、准确的检测工具显得尤为重要。在此背景下，艾沐蒽生物的Seq-MRD®产品提供了一个极具潜力的选择。基于高通量测序技术，Seq-MRD®能够以极高的灵敏度（达到10-6甚至更高）对MRD进行精确评估，确保即使在微量残留病灶存在的情况下也能被及时发现。
Seq-MRD®不仅提高了检测的准确性，还因其标准化流程减少了操作误差，使得结果更加可靠。此外，随着临床实践中对个性化治疗需求的增长，Seq-MRD®所提供的深度洞察将有助于医生根据患者的具体情况调整治疗策略，从而可能实现更佳的治疗效果和更高的生存质量。
Bruno Paiva
Bruno Paiva 教授在科研领域拥有卓越成就。他曾担任12个由公共或私人机构资助的研发项目的首席研究员（PI）或联合首席研究员（Co-PI），并在产学研合作方面经验丰富，已与安进、碧迪、BMS-Celgene、美天旎、杨森、罗氏、赛诺菲和武田等多家国际知名制药企业建立了超过15项研发合作协议。
在长达13年的科研生涯中，Paiva 教授共发表论文150篇，其中以第一作者身份发表37篇，以最后作者或通讯作者身份发表15篇。他的研究成果多次发表于医学与肿瘤学领域的顶级期刊，其中包括：《New England Journal of Medicine》（1篇）、《Nature Medicine》（1篇）、《Cancer Cell》（2篇）、《The Lancet Oncology》（4篇）和《Journal of Clinical Oncology》（4篇），此外，他在血液学领域的权威期刊上也发表了大量具有影响力的论文，例如：《Blood》（26篇）和《Leukemia》（23篇）。
其所有发表成果中，超过90%的文章刊登于各学科领域内公认的一线核心期刊。
艾沐蒽专注于免疫组二代测序领域多年，是全国首家推出血液肿瘤NGS MRD检测产品Seq-MRD®的公司。Seq-MRD®适用于B/T系白血病、B/T系淋巴瘤、多发性骨髓瘤，能够帮助临床医生预测长期疗效、评估治疗效果、监测缓解状态以及检测早期复发。经过多年的积累和发展，Seq-MRD®在临床检测和科学研究上均取得不少成果，并获得国际市场认可。
获得欧盟CE资质认证
Seq-MRD®获得欧盟CE资质（注册号：DE/CA20/01-IVD-Luxuslebenswelt-190/22），获批的是人淋巴B细胞微小残留病基因检测试剂盒（可逆末端终止测序法）。
获得三项发明专利
艾沐蒽推出的Seq-MRD®血液癌症MRD检测是最早批实现商业化的产品，自2016年研发专利技术至今，艾沐蒽Seq-MRD®已经获得3项国家发明专利：
[1]“一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒”（专 利 号: 2016 11204857.0，授权公告号:CN 106957906 B）
[2]“一种检测微小残留病MRD的试剂盒”（专 利 号: 2018 1 1550133.0，授权公告号: CN 109652518 B）
[3]“一种检测微小残留病MRD的方法”（专 利 号: 2018 1 1549203.0，授权公告号: CN 109680062 B）
获得相关软件著作
[1]“免疫组库MRD检测自动化报告系统[简称ImmuReport] V1.0”（登记号：2019SR0916207）
[2]“Seq-MRD检测自动化分析系统（DiscTermite）[简称：DiscTermite]0.4.6“（登记号：2019SR1131517）
[3]“基于免疫组库二代测序的微小残留病（MRD）检测数据处理系统”（登记号：2020SR0507594）
获得荣誉证书
1、艾沐蒽联合浙大附一黄河教授完成的《新型CAR-T细胞研发及其治疗恶性血液病临床转化创新体系建立》获2023年度浙江省科学技术进步奖一等奖。Seq-MRD®在该技术的创新与应用中起到了关键性作用。
2、艾沐蒽申报的“免疫组TCR/Ig高通量测序技术/血液肿瘤微小残留病（MRD）检测/Seq-MRD®”因其创新性、前沿性、市场实用性荣获“2022年度CCTB中国肿瘤标志物产业创新大会创新技术/产品评选”项目二等奖。
2023年获批了【全血/骨髓基因组DNA提取试剂盒】（离心吸附柱法）备案编号：浙杭械备20230798 ，试剂盒分别适用于人外周血、骨髓样本的核酸的提取。
发表相关文献
Seq-MRD®发表相关文献
1、Huang Y, Zhao H, Shao M, Zhou L, Li X, Wei G, Wu W, Cui J, Chang AH, Sun T, Hu Y, Huang H.Predictive value of next-generation sequencing-based minimal residual disease after CAR-T cell therapy. Bone Marrow Transplant.2022 Jun 1. doi: 10.1038/s41409-022-01699-2. Epub ahead of print. PMID: 35650329.（点击链接可查看文章内容）
2、Chen H, Gu M, Liang J, Song H, Zhang J, Xu W, Zhao F, Shen D, Shen H, Liao C, Tang Y, Xu X. Minimal residual disease detection by next-generation sequencing of different immunoglobulin gene rearrangements in pediatric B-ALL. Nat Commun. 2023 Nov 17;14(1):7468. doi: 10.1038/s41467-023-43171-9. （点击链接可查看文章内容）
3、Min’er Gu,Yahong Xia, Jingying Zhang, Yongmin Tang, Weiqun Xu, Hua Song Xiaojun Xu.The effectiveness of blinatumomab in clearing measurable residual disease in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia patients detected by next-generation sequencing. Cancer Med. 2023 Dec;12(24):21978-21984. doi:10.1002/cam4.6771. （点击链接可查看文章内容）
4、Yan N, Wang ZL, Wang XJ, et，al. Measurable residual disease testing by next generation sequencing is more accurate compared with multiparameter flow cytometry in adults with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Lett. 2024 Jul 4;598:217104. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217104.
获得国际市场认可
2023年DelveInsight公司发布的MRD国际市场研究报告中，艾沐蒽/Seq-MRD®是中国唯一一家公司/产品进入国际调研市场报告。DelveInsight是一家领先的医疗保健市场研究和商业咨询公司，以其现成的联合市场研究报告以及为医疗保健行业的公司提供的定制解决方案而闻名。
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，荣获浙江省科技进步一等奖，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® |免疫力测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、TCR-T和抗体发现等平台管线。目前为止发表了数十篇论文，其中包括：The New England Journal of Medicine(IF:158.5), Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。
