在肿瘤免疫治疗领域，抗原特异性T细胞受体（TCR）的激活是激发抗肿瘤免疫反应的核心环节。无论是免疫检查点抑制剂联合放疗，还是新兴的TCR-T细胞疗法，其成功都离不开对TCR 激活状态的精准验证。
本文将结合四项前沿研究，系统梳理如何从多维度、多层次验证T 细胞是否被肿瘤特异性新抗原真正激活，为免疫治疗研发提供坚实保障。
3 名长期生存患者（OS 46–104个月）
通过全外显子测序（WES）结合阴性与阳性对照，筛选克隆性体细胞突变（Fig 1），合成MANA肽段
采集患者基线、治疗第2-4 周期的PBMC，分离T细胞后与MANA肽段共培养，模拟体内激活过程
采用TCR 测序分析CD8+细胞的TCR 库，并通过MANAFEST 平台追踪特异性扩增的TCR 克隆动态
时间特异性：新抗原反应性TCR 仅在治疗后（第2–4周期）出现显著扩增
抗原依赖性：仅在对应MANA 肽刺激下发生克隆扩增，空白或无关节段无变化
TCR-T 细胞疗法的 “全流程指南”—— 新抗原的筛选、鉴定与临床应用
技术路径
step 1.突变识别与抗原设计（WES/RNA-seq + TMGs/突变肽库）
step 2.候选T细胞筛选（scTCR-CITE-seq + PD-1/CD39标记）
step 3.体外共培养激活（自体APCs负载新抗原 + IL-2）
step 4.TCR克隆与载体构建（流式分选 + 单细胞RT-PCR）
step 5.功能验证（IFN-γ释放、肿瘤杀伤实验）
step 6.患者T细胞扩增（制备临床级TCR-T产品）
step 7.临床回输与监测（疗效及安全性评估）
免疫原性检测：ELISPOT/ELISA 测IFN-γ 释放量（反映T 细胞活化强度），流式细胞术测4-1BB（CD137）表达（筛选活化T 细胞）。
TCR克隆特异性：通过NEST 技术（对比刺激前后TCR 频率）或 MANAFEST 实验，确认TCR 克隆仅被目标新抗原激活。
杀伤功能验证：LDH 释放法或CFSE/7-AAD 双染法，检测TCR-T 细胞对表达新抗原的肿瘤细胞的杀伤效率。
肿瘤类器官—— 体外验证TCR 激活的“微型肿瘤模型”
从同一患者分离PBMCs 和培养肿瘤类器官，使用IFN-γ 预处理类器官，使得MHC-I 分子上调；
在抗CD28 包被板中共培养T细胞与肿瘤类器官，加入IL-2 和抗PD-1 抗体；
每周使用新鲜类器官进行再刺激，共培养2周。
1.激活标志物：CD3+CD8+IFN-γ+ 或 CD3+CD8+CD107a+（Fig 3）
2.特异性响应：仅对自体肿瘤类器官有反应，正常组织或无关节器官无响应
3.杀伤验证：MHC-I 阻断后肿瘤存活率回升，活细胞成像显示凋亡增加
从患者转移灶处分离TIL 片段；
用负载新抗原的自体APCs 刺激；
加入IL-21和IL-2，选择性扩增14–19天。
Fig 4
活化标志物：流式检测 4-1BB + 或 OX-40+T 细胞比例，比例升高提示特异性激活。
功能响应：ELISPOT 检测 IFN-γ 斑点数，反映 T 细胞对新抗原的功能性应答。
TCR 克隆重建：从激活 T 细胞中克隆 TCRα/β 链，转导到健康供体 T 细胞中，通过 “肽段滴定实验” 确认其仅识别突变肽（不识别野生型）。
表型分析（scRNA-seq）：扩增的 T 细胞富集 “干细胞样记忆 T 细胞”（高表达 IL7R、TCF7，低表达 PD-1），具备长期存活和二次应答能力。
体内验证：
实验设置：NSG 小鼠皮下接种人肿瘤细胞（如表达 p53R175H 的 TYK-nu 细胞），静脉注射 NeoExpand 扩增的TILs。
结果：与传统扩增的TILs 相比，NeoExpand 组小鼠肿瘤生长显著减缓，部分小鼠肿瘤完全消退。
从联合治疗研究、TCR-T全流程开发，到类器官模型和NeoExpand新技术，多维度、多层次的TCR激活验证方法正在不断推动肿瘤免疫治疗向精准、高效的方向发展。通过综合运用多种分子生物学及功能性实验，我们能够更可靠地评估T细胞激活的特异性，为基于TCR癌症创新免疫疗法的成功应用保驾护航。
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3. Krijn K. Dijkstra, Chiara M. Cattaneo, Fleur Weeber et al., Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids, Cell, Volume 174, Issue 6, 2018, Pages 1586-1598.e12, https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.009.
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部分数据分析结果展示
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业和专精特新企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® 免疫力测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、新抗原、TCR和抗体发现等平台管线。目前为止发表了50余篇论文，其中包括：The New England Journal of Medicine(IF:158.5), Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。
