微小残留病MRD（Minimal/Measurable Residual Disease）的概念源自于血液肿瘤，是指肿瘤患者经过治疗后体内残留少量癌细胞的状态。残留的少量癌细胞可能暂时没有引起任何体征或症状，但它们可能导致未来肿瘤的进展或复发转移。因此MRD水平的监测十分重要，它可以改善危险度分层、评估治疗效果、监测复发、预测预后等，被纳入各个血液肿瘤诊疗指南中。
MRD检测手段经过数十年的发展，灵敏度不断升级。灵敏度越高，越能检测到深层次的MRD，与预后相关性也越高。因此高灵敏度的二代测序（NGS）MRD检测技术得到越来越广泛的应用。本文将为大家详细介绍血液肿瘤NGS MRD检测技术，并针对临床应用中的常见问题进行解答。
目前主流的MRD检测方法主要有MFC、BCR::ABL1检测、二代流式（NGF）、实时定量PCR（ASO-PCR）、IG/TR基因重排的NGS检测等。每种检测方法各有其优缺点，具体见下表，可根据需要选择合适的方法，也可多种检测方法综合评估MRD状态。
一篇发表于blood advances上的美国专家小组共识[1]（可点击链接查看详细解读）里建议：对于B-ALL患者，基于NGS的白血病特异性IG/TR克隆型MRD定量是临床决策的首选，因为该方法比其他检测具有更高的灵敏度和对复发的鉴别力。对于T－ALL患者，IG/TR的NGS检测和其他MRD检测是MRD评估的补充方法。
淋系血液肿瘤是T/B淋巴细胞发生癌变而导致，当T/B淋巴细胞发生癌变时，会大量复制增殖。而其表面的生物标志物TCR/BCR是不发生改变的，通过高通量测序找到这些出现频率很高的癌细胞受体VDJ基因序列，在治疗后对此基因序列进行追踪，查找其克隆情况，得到MRD值。
图1
这不同于基因突变检测等其它基因测序，基因突变检测是分析DNA构象或解链特性，或者利用DNA变性和复性等特性，进行DNA突变的分析，也就是通过一些基因突变信息来鉴定癌细胞。而NGS MRD是基于测到的可变区序列( 克隆)频率高低来鉴定癌细胞，两者检测原理不同。即便癌细胞DNA发生了突变，TCR/BCR通常是稳定不变的，依然可以进行追踪。
有别于MFC、NGF、BCR::ABL1检测的是，NGS MRD检测必须得有治疗前样本进行基线检测，鉴定出癌细胞克隆序列之后，才能进行治疗后的癌细胞克隆追踪，评估MRD水平。需要注意的是，当没有可用的初诊样本时，不建议用治疗后样本代替进行基线检测，因为鉴定不出可供追踪的癌细胞克隆的风险比较高，且治疗后的显著性克隆不一定来自癌细胞，也可能是应激反应性克隆。
基线检测之后的MRD检测时机和频率可根据患者病情变化和治疗情况决定，也可参考各诊疗指南中关于MRD检测时机的建议（详见“史上最全淋系血液肿瘤MRD检测时机总结”），一般是各个治疗阶段结束后进行MRD检测，维持治疗期和随访期间根据疾病缓解情况制定MRD监测方案，若连续多次结果为阴性，检测间隔时间可逐渐延长。
图2
对于淋系白血病和多发性骨髓瘤（MM）来说，首先新鲜骨髓（BM）样本进行MRD检测，但外周血（PB）的MRD监测具有避免频繁侵入性骨髓采样的优点。有研究证明了基于PB和BM的NGS MRD检测结果具有很强的相关性。但是PB中的疾病负担可能比BM低1到2个对数倍，因此PB监测可能无法检测到非常低水平的MRD。
对此，有专家建议：对于BM受累的患者，建议至少在记录到MRD阴性之前监测BM MRD。在使用高质量BM样本达到MRD阴性后，可以考虑进行PB MRD监测（单独或与定期BM评估交替），最好使用高灵敏度的NGS MRD检测，以减少侵入性BM检查的频率[1]。
Bruno Paiva教授发表于Nature Reviews Clinical Oncology的关于MM MRD检测的重磅综述（可点击链接查看详细解读）里也提到：对于在治疗初期实现MRD阴性的患者，为了避免在较短时间内进行多次骨髓穿刺，建议每两年进行一次骨髓MRD评估并结合每6个月一次的外周血残留病（PRD）评估（通过MS、NGF或NGS）。如果PRD持续阴性，则可能意味着MRD仍处于阴性状态；若PRD出现回升，则自动视为MRD阴性丧失的标志，无需再次骨髓穿刺确认[2]。
图3
除了新鲜样本之外，细胞、DNA、骨髓涂片等可储存样本类型也可用作NGS MRD检测，这可以满足一些科研需求。
gDNA还是ctDNA？
基于Ig/TR基因克隆重排的NGS MRD检测是提取样本中的DNA进行多重PCR构建文库，然后高通量测序。选择gDNA（genomic DNA）还是ctDNA（Circulating Tumor DNA）是由疾病类型决定的。
T/B系白血病、多发性骨髓瘤通常是提取骨髓/外周血中的gDNA进行检测。而对于T/B系淋巴瘤来说，骨髓和外周血中不一定有癌细胞累及，其初诊的克隆性检测建议使用肿瘤组织样本提取gDNA进行检测，MRD追踪检测（治疗后）需要提取外周血ctDNA（ctDNA是肿瘤细胞DNA经脱落或当细胞凋亡后释放进入循环系统的DNA碎片）进行残留检测。若无法提供初诊的肿瘤组织样本，只能提供骨髓/外周血样本的话，需要临床医生确认骨髓/外周血中是有癌细胞累及的。
cDNA（complementary DNA）是由RNA逆转录而来，也可用于免疫组Ig/TR测序，尤其适用于与疾病抗原相关的研究，但不适合作为MRD检测的模板，原因如下：
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癌细胞克隆可能是功能性序列，也可能是不发生RNA转录和表达的非功能性序列，使用RNA逆转录的cDNA作为模板有癌细胞漏检的风险。
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一个细胞对应多个mRNA拷贝，而只对应一个gDNA拷贝，故gDNA更适合用于MRD检测中进行癌细胞定量评估。
多克隆型是指初诊未检测到可供追踪的显著性克隆，这部分比例大约在4%-9%。当基线检测为多克隆型时，可以使用不需要初诊样本的其他MRD评估替代方法（如流式等）；或者考虑送检第二个高质量样本进行重复基线检测；也可以考虑对没有显著性克隆的B-ALL患者进行TR基因重排检测，可能会在某些患者中识别出可追踪的序列。
预后价值大小与链独特性有关，目前的研究是认为IGH链的独特性最高，比其他链更具有预后意义。TCR各条链是否存在预后价值差异还有待更多研究。
图4
在治疗后样本中被鉴定出的显著性克隆被称为新发显著性克隆。新发显著性克隆在化疗、抗体药和移植等治疗过程中均可能会出现。在目前的研究中，大多数新出现的显著性克隆序列可能代表与疾病无关的克隆扩增，并且往往会随着时间的推移退化到背景克隆中；较少情况下一些新出现的显著性克隆序列可能与复发存在关联。对于不确定的病例，建议进行密切的连续MRD监测以观察序列的动态变化。
Michael A. Pulsipher教授2024年在blood杂志发表文章分享了其在儿童和成人ALL患者中应用NGS MRD检测指导造血干细胞移植（HCT）治疗的经验，对临床具有借鉴意义。解读详见Blood|全面且深度解读如何利用NGS MRD改善ALL风险分层和预防复发。
NGS MRD在HCT前后均可提供有价值信息，指导临床决策。有研究表明，在HCT之前通过NGS检测到任何水平MRD都可以预测移植后复发风险增加和生存期较差。NGS MRD结果还可以在一定程度上指导移植预处理、移植物抗宿主病（GVHD）预防和移植后维持治疗方案，比如对于移植后持续或新出现NGS MRD阳性患者，在移植后早期减少或撤销免疫抑制以诱导移植物抗白血病效应（GVL）是一种有价值的策略。HCT后长期监测NGS MRD可以为MRD阳性患者提早发出警报，以提供早期干预的机会。
艾沐蒽专注于免疫组二代测序领域多年，是全国首家推出血液肿瘤NGS MRD检测产品Seq-MRD®的公司。Seq-MRD®适用于B/T系白血病、B/T系淋巴瘤、多发性骨髓瘤，能够帮助临床医生预测长期疗效、评估治疗效果、监测缓解状态以及监测早期复发。经过多年的积累和发展，Seq-MRD®在临床检测和科学研究上均取得不少成果，并获得国际市场认可。
获得欧盟CE资质认证
Seq-MRD®获得欧盟CE资质（注册号：DE/CA20/01-IVD-Luxuslebenswelt-190/22），获批的是人淋巴B细胞微小残留病基因检测试剂盒（可逆末端终止测序法）。
获得三项发明专利
艾沐蒽推出的Seq-MRD®血液癌症MRD检测是最早批实现商业化的产品，自2016年研发专利技术至今，艾沐蒽Seq-MRD®已经获得3项国家发明专利：
[1]“一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒”（专 利 号: 2016 11204857.0，授权公告号:CN 106957906 B）
[2]“一种检测微小残留病MRD的试剂盒”（专 利 号: 2018 1 1550133.0，授权公告号: CN 109652518 B）
[3]“一种检测微小残留病MRD的方法”（专 利 号: 2018 1 1549203.0，授权公告号: CN 109680062 B）
获得相关软件著作
[1]“免疫组库MRD检测自动化报告系统[简称ImmuReport] V1.0”（登记号：2019SR0916207）
[2]“Seq-MRD检测自动化分析系统（DiscTermite）[简称：DiscTermite]0.4.6“（登记号：2019SR1131517）
[3]“基于免疫组库二代测序的微小残留病（MRD）检测数据处理系统”（登记号：2020SR0507594）
获得荣誉证书
1、艾沐蒽联合浙大附一黄河教授完成的《新型CAR-T细胞研发及其治疗恶性血液病临床转化创新体系建立》获2023年度浙江省科学技术进步奖一等奖。Seq-MRD®在该技术的创新与应用中起到了关键性作用。
2、艾沐蒽申报的“免疫组TCR/Ig高通量测序技术/血液肿瘤微小残留病（MRD）检测/Seq-MRD®”因其创新性、前沿性、市场实用性荣获“2022年度CCTB中国肿瘤标志物产业创新大会创新技术/产品评选”项目二等奖。
2023年获批了【全血/骨髓基因组DNA提取试剂盒】（离心吸附柱法）备案编号：浙杭械备20230798 ，试剂盒分别适用于人外周血、骨髓样本的核酸的提取。
发表相关文献
Seq-MRD®发表相关文献
1、Huang Y, Zhao H, Shao M, Zhou L, Li X, Wei G, Wu W, Cui J, Chang AH, Sun T, Hu Y, Huang H. Predictive value of next-generation sequencing-based minimal residual disease after CAR-T cell therapy. Bone Marrow Transplant. 2022 Jun 1. doi: 10.1038/s41409-022-01699-2. Epub ahead of print. PMID: 35650329.（点击链接可查看文章内容）
2、Chen H, Gu M, Liang J, Song H, Zhang J, Xu W, Zhao F, Shen D, Shen H, Liao C, Tang Y, Xu X. Minimal residual disease detection by next-generation sequencing of different immunoglobulin gene rearrangements in pediatric B-ALL. Nat Commun. 2023 Nov 17;14(1):7468. doi: 10.1038/s41467-023-43171-9. （点击链接可查看文章内容）
3、Min’er Gu,Yahong Xia, Jingying Zhang, Yongmin Tang, Weiqun Xu, Hua Song Xiaojun Xu. The effectiveness of blinatumomab in clearing measurable residual disease in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia patients detected by next-generation sequencing. Cancer Med. 2023 Dec;12(24):21978-21984. doi:10.1002/cam4.6771. （点击链接可查看文章内容）
4、Yan N, Wang ZL, Wang XJ, et，al. Measurable residual disease testing by next generation sequencing is more accurate compared with multiparameter flow cytometry in adults with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Lett. 2024 Jul 4;598:217104. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217104.
获得国际市场认可
2023年DelveInsight公司发布的MRD国际市场研究报告中，艾沐蒽/Seq-MRD®是中国唯一一家公司/产品进入国际调研市场报告。DelveInsight是一家领先的医疗保健市场研究和商业咨询公司，以其现成的联合市场研究报告以及为医疗保健行业的公司提供的定制解决方案而闻名。
1.Short NJ, et al. Clinical use of measurable residual disease in adult ALL: recommendations from a panel of US experts. Blood Adv. 2025 Mar 25;9(6):1442-1451.
2.Paiva, B., Shi, Q., Puig, N. et al. Opportunities and challenges for MRD assessment in the clinical management of multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol (2025).
3.Chen H, et al. Minimal residual disease detection by next-generation sequencing of different immunoglobulin gene rearrangements in pediatric B-ALL. Nat Commun. 2023 Nov 17;14(1):7468.
4.Muffly L, et al. How I Use Next Generation Sequencing-MRD to Plan Approach and Prevent Relapse after HCT for Children and Adults with ALL. Blood. 2024 May 10:blood.2023023699.
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® 免疫力测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、TCR-T和抗体发现等平台管线。目前为止发表了数十篇论文，其中包括：The New England Journal of Medicine(IF:158.5), Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。
