B细胞和抗体免疫组库全长测序Ig-Seq

ImmuHub®

为您提供灵敏、准确、全面的B细胞免疫组库(BCR)测序
ImmuHub®通过基于第二代高通量基因测序技术为血液、骨髓或组织样本提供非常全面的 BCR (IGH, IGL & IGK)测序分析。我们会对测序后数据进行详细得生物信息学处理及数据分析,并且能保证每个样本的测序过程和分析结果在整个实验中的一致性,最大程度得减少实验结果误差。
Antibody Subclass Repertoire and Graft Outcome Following Solid Organ Transplantation . Front Immunol. PMCID: PMC5075576

机体体液免疫应答主要由B细胞介导,并可通过产生特异性抗体来应答抗原,对机体起重要保护作用。TI抗原和TD抗原均可诱导发生体液免疫,但TI抗原可直接诱导B细胞产生IgM抗体介导的免疫反应,无免疫记忆性,而TD抗原诱导的免疫反应应答需要Th细胞辅助。B细胞抗原受体(B cell receptor,BCR)是B细胞识别抗原的一种膜表面免疫球蛋白(SmIg),具有抗原结合特异性。当BCR与特异性抗原结合,产生B细胞活化第一信号,同时B细胞通过内化作用将BCR结合的抗原摄入胞内,对抗原进行加工处理,形成抗原肽-MHCⅡ类分子复合物并提呈给Th细胞,Th细胞活化后高表达CD40L并与B细胞膜上的CD40结合可提供B细胞活化的第二信号。活化的Th细胞可分泌细胞因子活化B细胞,活化的B细胞可分化为产生抗体的浆细胞。部分B细胞分化成记忆B细胞,当再次接触相同抗原后可迅速增殖分化成浆细胞,产生抗体,参加再次免疫应答。

由于B细胞与机体的免疫功能密切相关,例如发生自身免疫病、食物过敏、传染性疾病、B细胞淋巴白血病等其他血液癌症都会引起BCR多样性的变化。

BCR是由两条重链(H)和两条轻链λ)组成的四聚体,其中重链分为可变区(V)、恒定区(C)、跨膜区及胞质区;轻链则只有V区和C区。V区由3个互补决定区(CDR1CDR2CDR3)组成,CDR的氨基酸/基因组成和排列顺序呈现高度多样性,在同一个体内,这种多样性可达109~1012,构成容量巨大的BCR库。正是这种多样性的存在,正常机体几乎能够对入侵的所有异物产生免疫应答。    

Adrian Wiestner. The Role Of B-Cell Receptor Inhibitors In The Treatment Of Patients With Chronic Lymphocytic Leukemia.

ImmuHub®的技术优势

更少实验误差,更全面准确的分析

• 基于 RNA 的分析检测,这样除去了内含子,避免了不必要的引物及消耗和结果误差,获得的数据是基于表达的(有功能的)T、B细胞受体;
• 单对引物(5'RACE)文库构建准确率高,测序数据与IMGT ® 数据库基因座匹配正确率可达97%-99.7%,并能扩增TCR和BCR的V-(D)-J 序列全长(包括 FR1-4 和 CDR1-3);
• 深度测序并使用世界领先生物信息学分析算法对数据进行处理,可进行下机数据全自动生信分析(无人值守)及纠错,纠正PCR和测序引入的错误,有更强的纠错能力和错配处理能力,更大程度的获得有效数据,挖掘测序获得的有效信息;
• 自主研发PCR反应体系稳定,接头序列连接效率高、目标基因扩增效率高;扩增灵敏度极高,RNA模板量最小化,最低可达10ng,为小或珍惜临床样本(如肿瘤病人骨髓或穿刺样本)获得测序可能性;
• BCR文库构建使用的优化引物可有效鉴别更多IGH链亚型,如IgA1, IgA2,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,IgE,IgM等;
• 相对多重PCR技术,可以完全避免引物偏好性。

提取样本 RNA

我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的B细胞的 RNA,RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用,我们的每一步都会通过先进的设备,如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.),对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好,我们不会进行下一步,我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

cDNA 合成和文库构建

我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的B细胞的 RNA,RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用,我们的每一步都会通过先进的设备,如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.),对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好,我们不会进行下一步,我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

单对引物(5'RACE)文库构建技术示例

基于UMB的超强纠错​​

在原始RNA模板扩增前加入UMB(Unique Molecular Barcode,独立分子条形码)进行文库构建,可对后续PCR反应或测序过程中的错误进行有效纠正,还原真实的数据,完全杜绝PCR错误和测序错误,从而提高准确率。 模拟无PCR化测序,还原PCR之前的真实分子数量。

保留突变信息,纠正测序错误信息

高通量测序

我们可使用 MiSeq® (Illumina Inc.) 2 × 300 bp pair-end 方法来对 BCR 进行测序,保证 BCR 的全长序列和IGH亚型信息都可获得。亦可使用HiSeq®  X10以获得更大的通量和更便宜的价格。

数据分析

BCR 的测序数据将通过我们世界领先的生物信息学分析算法进行处理

Figure Samples

ImmuHub®的测序服务步骤

服务流程:客户提供样本,通常为全血、骨髓、单个核细胞、分离后的B细胞、RNA/cDNA或者石蜡包埋的组织[FFPE],送达公司实验室后,实验室根据样本的情况,进行血液或骨髓的B细胞分离→ RNA 提取→ cDNA 合成→测序文库构建第二代基因测序→生物信息学处理→数据分析和出图→临床信息分析(如下图)。 45个工作日后客户获得测序结果报告。

基本数据分析

  • BCR种类数和FR1-4,CDR1-3 的序列
  • IGH亚型信息
  • V-(D)-J-C gene ID 信息
  • 每一个 V-(D)-J 序列的组合信息
  • 多样性指数的计算、克隆群比例
  • 绘制V/J基因表达的2D、3D图

深度数据分析

BCR状态的统计、总结、谱系等

  • 计算样本的统计总结:序列读数、平均克隆种类大小,无功能克隆种类数等
  • 计算样本每个V和J基因的使用率,绘制基于标准分数(z-Score)的热力图(heatmap)
  • 计算CDR3克隆种类长度的高斯分布,绘制前N个最高表达CDR3克隆的谱系图
  • 绘制V-J基因配对频率图、3D森林图
  • 基于CDR3基因长度,计算和绘制V基因的分布图

样本BCR多态性和克隆性评价

  • 计算、比较样本间多样性和克隆性 (计算 Shannon、Simpson、Berger-Parker指数)
  • 绘制样本多态性、克隆性图谱

IMG_9916Immun-Cheq 样本间BCR克隆种类重合、共享分析 (overlap and sharing)

  • 计算两个样本BCR克隆种类的共享情况,追踪同一个病人治疗前后某个克隆种类变化
  • 绘制两个样本间克隆种类配对比较图

我们也将按照客户的要求提供更多的分析和不同的数据报告形式,数据结果将以电子文档的形式传送给客户。