T细胞免疫组库全长测序 TR-Seq

ImmuHub®

为您提供灵敏、准确、全面的T细胞免疫组库（TCR）测序
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ImmuHub®通过基于第二代高通量基因测序技术为血液、骨髓或组织样本提供非常全面的 TcR 测序分析。我们会对测序后数据进行详细得生物信息学处理及数据分析，并且能保证每个样本的测序过程和分析结果在整个实验中的一致性，最大程度得减少实验结果误差。

T 细胞属于人体免疫细胞，它在肿瘤免疫治疗，自身免疫疾病以及移植耐受等方面发挥着重要的作用。每个 T 细胞都有自己特殊的 T 细胞受体 (TcR)，就像每一个细胞的身份证。对TcR测序分析可以准确监测我们免疫系统对疾病和治疗的反应，可以帮助科研者了解疾病与免疫系统的相互作用。

TcR 作用是识别抗原。T 细胞通过细胞表面的 TcR 来识别抗原呈递细胞带来的抗原，每一个 T 细胞含有一个特异的 TcR 用来识别相对特异的抗原。T 细胞通过 TcR 基因的重组从而达到其多样化 (Diversity) 的特点（如下图），并可识别各种抗原与之反应。

T 细胞受体是由α链和β链组成的（如图）。TcR 转录子是通过基因组里的α链或β链上的 V,(D),J 基因随机排序出来的。抗原主要结合的区域叫 CDR3 (Complementarity Determining Region 3)，TcR 会经常出现核苷酸随机重组，所以每个人的 T 细胞受体就会有很高的多样性，这样就造成了 T 细胞受体的种类理论上会高达 1018 种。所以对健康的人和病人的 T 细胞受体测序是做好预防医学和个性化治疗的基础。

Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al.

ImmuHub®的技术优势

更少实验误差，更全面准确的分析

• 基于 RNA 的分析检测，这样除去了内含子，避免了不必要的引物及消耗和结果误差，获得的数据是基于表达的（有功能的）T、B细胞受体；
• 单对引物（5‘RACE）方法文库构建准确率高，测序数据与IMGT ® 数据库基因座匹配正确率可达97%-99.7%，并能扩增TCR和BCR的V-(D)-J 序列全长(包括 FR1-4 和 CDR1-3)；
• 深度测序并使用世界领先生物信息学分析算法对数据进行处理，可进行下机数据全自动生信分析(无人值守)及纠错，纠正PCR和测序引入的错误，有更强的纠错能力和错配处理能力，更大程度的获得有效数据，挖掘测序获得的有效信息；
• 自主研发PCR反应体系稳定，接头序列连接效率高、目标基因扩增效率高；扩增灵敏度极高，RNA模板量最小化，最低可达10ng，为小或珍惜临床样本（如肿瘤病人骨髓或穿刺样本）获得测序可能性；
• BCR文库构建使用的优化引物可有效鉴别更多IGH链亚型，如IgA1, IgA2，IgG1, IgG2, IgG3, IgG4，IgE，IgM等；
• 相对多重PCR技术，可以完全避免引物偏好性。

提取样本 RNA

我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的T细胞亚型的 RNA，RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用，我们的每一步都会通过先进的设备，如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.)，对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好，我们不会进行下一步，我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

cDNA 合成和文库构建

我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的T细胞亚型的 RNA，RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用，我们的每一步都会通过先进的设备，如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.)，对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好，我们不会进行下一步，我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

单对引物（5'RACE）文库构建技术示例

基于UMB的超强纠错​

在原始RNA模板扩增前加入UMB（Unique Molecular Barcode，独立分子条形码）进行文库构建，可对后续PCR反应或测序过程中的错误进行有效纠正，还原真实的数据，完全杜绝PCR错误和测序错误，从而提高准确率。 模拟无PCR化测序，还原PCR之前的真实分子数量。

保留突变信息，纠正测序错误信息

高通量测序

我们可使用 MiSeq® (Illumina Inc.) 2 × 300 bp pair-end 方法来对 TcR 进行测序，保证 TcR 的全长序列都可获得。亦可使用HiSeq®  X10以获得更大的通量和更便宜的价格。

数据分析

TcR 的测序数据将通过我们世界领先的生物信息学分析算法进行处理

Figure Samples

ImmuHub®的测序服务步骤

服务流程:客户提供样本，通常为全血、骨髓、单个核细胞、分离后的T细胞、RNA/cDNA或者石蜡包埋的组织[FFPE]，送达公司实验室后，实验室根据样本的情况，进行血液或骨髓的T细胞分离→ RNA 提取→ cDNA 合成→测序文库构建→第二代基因测序→生物信息学处理→数据分析和出图→临床信息分析（如下图）。 45个工作日后客户获得测序结果报告。

基本数据分析

  • TcR种类数和FR1-4，CDR1-3 的序列
  • V-(D)-J-C gene ID 信息
  • 每一个 V-(D)-J 序列的组合信息
  • 多样性指数的计算、克隆群比例
  • 绘制V/J基因表达的2D、3D图

深度数据分析

TcR状态的统计、总结、谱系等

  • 计算样本的统计总结：序列读数、平均克隆种类大小，无功能克隆种类数等
  • 计算样本每个V和J基因的使用率，绘制基于标准分数（z-Score）的热力图（heatmap）
  • 计算CDR3克隆种类长度的高斯分布，绘制前N个最高表达CDR3克隆的谱系图
  • 绘制V-J基因配对频率图、3D森林图
  • 基于CDR3基因长度，计算和绘制V基因的分布图

样本TcR多态性和克隆性评价

  • 计算、比较样本间多样性和克隆性 (计算 Shannon、Simpson、Berger-Parker指数)
  • 绘制样本多态性、克隆性图谱

IMG_9916Immun-Cheq 样本间TcR克隆种类重合、共享分析 （overlap and sharing）

  • 计算两个样本TcR克隆种类的共享情况，追踪同一个病人治疗前后某个克隆种类变化
  • 绘制两个样本间克隆种类配对比较图

我们也将按照客户的要求提供更多的分析和不同的数据报告形式，数据结果将以电子文档的形式传送给客户。

【1.】 T细胞受体基因的专业术语起初是两个字母——“TR”，由国际人类基因命名委员会（HGNC）1999年审核通过。因而当提及到基因、基因座和链时，TR应该是最准确的描述。不过TcR是目前用得最广泛的。但是，大写的 ”TCR“ 缩写混淆了基因命名，应该避免。