免疫组库测序主流分为 DNA、RNA 两种核酸模板，搭配多重 PCR、5’RACE 两大建库方案。RNA 相对来说质量较为不稳定，容易发生降解，对 5’RACE 建库测序结果影响较大。
艾沐蒽全新推出 RNA-3’RACE 免疫组库建库技术，针对性攻克 RNA 降解难题，且能兼顾 UMI（独特分子条形码）纠错技术，为客户提供更多选择。
不同的核酸模板和不同的建库方法各有其特点和适用场景，此前艾沐蒽已系统科普，详情可查阅原文：一文讲清！免疫组测序技术研究：RNA VS DNA？多重PCR VS 5’RACE？
总结如下：
两种建库方法各有其优势，但现存痛点也很突出：5’RACE 高度依赖 RNA 5′ 端完整，石蜡样本、存档多年陈旧组织样本、反复冻融样本等多降解严重，5′ 大片段大量缺失，常规5’RACE 文库构建失败率高。而多重 PCR 建库方法虽然受降解的影响相对小，但缺少 UMI 标签，无法剔除 PCR /测序错误，不能还原 PCR 扩增前的真实克隆状态，且对于 BCR 测序来说也无法获得抗体亚型信息。
因此，艾沐蒽 ImmuHub® 推出全新自研 RNA-3’RACE 建库技术，专为 RNA 降解样本量身打造，即克服了 5’RACE 技术对 RNA 完整性的高度依赖，又弥补了多重 PCR 技术无 UMI 纠错的缺憾（仅限人TRB、IGH测序）。
有研究证实：石蜡样本如 FFPE 来源RNA被内源核糖核酸酶（RNase）切割时，降解规律固定 ——5′ 端优先断裂丢失，3′ 端靠近 poly (A) 尾的短片段（50–800 bp）保留完整。
5’RACE 短板：扩增需要完整全长转录本，锚定 5′ 端接头位点，一旦 5′ 端片段断裂缺失，引物无结合位点，导致文库构建失败。
3’RACE 技术优势：不依赖 5′ 端核酸完整性，靶向捕获靠近 polyA 尾的 3′ 端短片段，仅需保留 C 区附近序列即可完成扩增，对 RNA 降解耐受性更高（重度降解样本除外）。
3’RACE 和 5’RACE 建库方法虽然都是基于 RNA 模板且引入了 UMI 技术，但其技术路线完全不同：
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RNA+3’RACE_UMI：在 RNA 逆转录成 cDNA 的时候，在恒定区（ C 区）添加带有 UMI 的linker，PCR 扩增时采用 V 区多重引物+ C 区linker引物配对扩增，靶向富集 CDR3 区+部分 C 区序列。
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RNA+5’RACE_UMI：在 RNA 逆转录成 cDNA 的时候，在 5′ 端添加带有 UMI 的 adapter（接头），通过接头和 C 区单对引物即可进行 PCR 扩增，靶向富集 TCR/BCR VDJ 全长+部分 C 区序列。
5’RACE 建库主要优势：
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单对引物可避免 PCR 扩增偏好性；
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基于 UMI 技术可消除 PCR 扩增重复，纠正 PCR 和测序错误；
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扩增 VDJ 全长区域，可匹配 PE150/PE250/PE300 多种测序模式从而获得 CDR3 区/ VDJ 全长；
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可获得 C 区信息和抗体亚型信息。
样本质量合格时优先选择 5’RACE 建库方法。
3’RACE 建库主要优势：
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具备 UMI 技术的优点；
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可获得 C 区信息和抗体亚型信息；
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对 RNA 完整性依赖程度低于 5’RACE 方法。
当 RNA 有中度降解，且看重 UMI 技术，或需要获得抗体亚型信息，3’RACE 方法可作为次优选。
多重 PCR 法建库主要优势：
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既可匹配 cDNA 模板又可匹配 gDNA 模板，匹配 gDNA 模板可相对定量细胞数。
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对核酸完整性依赖程度低，对样本质量要求低。
需要定量细胞数，或样本质量差如冻存全血、石蜡样本，首选 DNA+多重 PCR 法。
艾沐蒽 ImmuHub® 免疫组测序平台，5’RACE / 3’RACE / 多重 PCR 多种建库方案全覆盖，一站式满足各种样本类型免疫组测序需求！
参考文献
Boneva, S., Schlecht, A., Böhringer, D. et al. 3′ MACE RNA-sequencing allows for transcriptome profiling in human tissue samples after long-term storage. Lab Invest 100, 1345–1355 (2020). https://doi.org/10.1038/s41374-020-0446-z
艾沐蒽专注于免疫驱动医学领域多年，开发的ImmuHub®技术平台方法全面，检测物种多样，建库方法具有灵活性，致力于为各大高校、医院、科研机构、企业等提供优良的科研服务。
ImmuHub®部分科研方向
ImmuHub®适用基因座
部分数据分析结果展示
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业和专精特新企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® 免疫力测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、新抗原、TCR和抗体发现等平台管线。目前为止发表了60余篇论文，其中包括：The New England Journal of Medicine(IF:158.5), The Lancet(IF:98.4), Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。
