2026年5月，斯坦福大学K. Christopher Garcia团队联合芝加哥大学Aly A. Khan团队于《Nature Biotechnology》刊发最新研究。该研究融合高通量酵母展示技术与蛋白质语言模型，成功构建T细胞受体（TCR）肽段识别全景图谱（PRPs）。研究证实，TCR的功能活性主要由其抗原识别模式决定，而非氨基酸序列相似度；同时筛选出强直性脊柱炎等自身免疫病相关新型抗原，为免疫疾病机制探究及免疫治疗研发奠定了全新技术基础。
摘要
T细胞受体（TCR）的抗原特异性无法仅通过序列信息进行可靠预测，序列高度相似的TCR可能识别完全不同的抗原，而序列差异显著的TCR却可能识别同一抗原。本研究构建了一套整合实验与计算的技术体系，通过高通量酵母展示技术与微调后的蛋白质语言模型（pLMs）相结合，为单个TCR生成肽识别全景图谱（PRPs），全面解析其与数百万种肽段的结合特性。
本研究聚焦于强直性脊柱炎与急性前葡萄膜炎患者来源的HLA-B*27:05限制性TCR，此类TCR的抗原识别主要由CDR3β链介导。基于PRPs训练的模型，在T细胞活化预测任务中的性能显著优于AlphaFold3等传统结构预测工具。
研究证实，模型对新TCR的泛化能力与功能距离（PRP差异度）高度相关，而非序列相似性；同时引入了模型固有不确定性指标以量化预测置信度，为疾病相关抗原的发现及TCR工程化改造提供了高效、可规模化的技术路径。
引言
TCR识别抗原肽-MHC复合物是适应性免疫的核心，但TCR序列与抗原特异性无固定对应关系，传统序列分析法、主流结构预测模型均存在明显短板，难以挖掘自身免疫病相关隐蔽抗原。本研究整合高通量实验与机器学习技术，构建平台并绘制TCR肽识别全景图谱。该体系可精准预测T细胞活化，成功鉴定出强直性脊柱炎、急性前葡萄膜炎的新型自身抗原，同时明确模型泛化依据为TCR功能差异，为免疫研究与免疫疗法研发提供了新方案。
方法
一、TCR筛选
研究共纳入16种来自强直性脊柱炎、急性前葡萄膜炎样本的疾病相关TCR，分为三类：
（1）公共家族TCR：含TCR4.1、8.4、9.1，均为HLA-B*27阳性患者来源，经流式分选、单细胞测序获得，属经典BV9公共家族。
（2）非BV9 TCR：以TCR019.1为代表，取自葡萄膜炎患者房水，不携带经典基序，拓展了TCR家族范围。
（3)YeiH四聚体分选TCR：含9种TCR，来自患者外周血，经抗原特异性四聚体筛选，覆盖多种克隆型。
二、工程化TCR与α链互换
构建突变体：在 TCR19.2的CDR3β引入1-3个氨基酸突变，保留 α链，获得5种工程变体，用于模型泛化测试。
构建嵌合TCR：互换匹配的α链，验证β链主导识别的机制，在细胞中表达并检测活化差异。
三、PSG5四聚体流式检测
伦理与入组：研究符合伦理，患者严格按疾病标准入组，健康对照无自身免疫病，均确认为HLA-B*27阳性。
样本处理：采集外周血，分离冻存免疫细胞，用于后续流式检测。
流式染色：用PSG5等特异性四聚体标记细胞，染色、固定后上机检测，分析抗原特异性T细胞频率。
四、TCR蛋白表达
将TCRα/β链克隆至载体，共转染Expi293细胞，表达后经亲和、浓缩、生物素化、层析纯化，获得高纯度TCR。
五、酵母肽文库构建与筛选
构建含固定锚定残基的9肽酵母文库，经多轮阳性、阴性筛选，富集特异性肽序列，用于深度测序。
六、文库深度测序
提取酵母DNA，扩增肽序列，测序后分析富集肽种类、数量，构建 TCR识别数据集。
七、T 细胞活化实验
载体构建：将TCR、HLA分别导入慢病毒载体，感染细胞获得稳定表达细胞系。
共培养检测：抗原呈递细胞负载肽，与T细胞共培养，检测活化标志物。
八、HLA蛋白原核表达
HLA重链、β2m在大肠杆菌中以包涵体表达，裂解洗涤后溶解备用。
九、pMHC复性
将肽、HLA重链、β2m混合复性，透析纯化，获得功能性pMHC复合物。
十、复合物结晶与结构解析
纯化TCR-pMHC复合物，结晶、衍射、解析原子结构，阐明识别机制。
结果
一、搭建整合平台，绘制TCR-肽识别全景图谱
打造实验与计算结合的技术平台,解析TCR与肽抗原的作用规律。借助高通量酵母展示联合二代测序技术，检测TCR和肽段的结合情况。针对特定分型设计肽库，固定关键锚定氨基酸，兼顾肽库稳定性与检测全面性。团队利用16种关联强直性脊柱炎、急性前葡萄膜炎的TCR完成测试，得到海量识别数据，并结合蛋白质语言模型建模分析TCR作用规律。
作者通过Fig.2给出了整篇文章的核心：PRP不是给TCR做普通分类，而是把TCR放进“肽识别空间”里重新定位。真正能定义TCR关系的，是它们识别肽的整体模式。
Fig.2从序列、结构到功能，层层递进地揭示了HLA-B*27相关TCR的多样性：
序列≠功能：即使序列相似，TCR的交叉反应性和肽识别谱也可能完全不同。
结构决定特异性：β链主导的识别模式是这类TCR的共性特征。
功能距离是关键：基于肽识别全景图谱的分析，比传统的序列分析更能反映TCR的真实特异性。
这也是后续研究中，模型预测性能优于传统序列/结构方法的根本原因。
二、PRPs证实TCR功能聚类和序列相似性无关
选用16种致病相关TCR，其CDR3区域存在明显序列差异。结构分析显示，这类TCR主要依靠β链实现与肽段的结合。通过计算功能距离、多维标度可视化等方式分析发现，TCR会依据肽识别偏好形成独立类群，该聚类结果和基因序列相似度没有关联，也通过多种降维算法验证了结论的稳定性。
三、依托PRP优化模型，精准预测肽段结合特性
利用肽识别图谱数据微调蛋白质语言模型，模型可高效区分结合与非结合肽段。实验对比发现，新增α链序列并不能提升预测效果，证明β链是决定肽识别特异性的核心。并且定位出影响结合效果的关键氨基酸位点，同时利用模型筛查人类蛋白组，筛选出十余种可结合多种致病TCR的潜在自身抗原。
Fig.3直观展示了模型的核心作用：用PRP训练蛋白语言模型，让模型学会TCR识别肽的规则的步骤。
结构背景：展示了TCR8.4、19.2、4.3与HLA-B*27:05-肽复合物的结构。
实验肽基序：上方的序列Logo图，是从酵母展示数据中得到的真实结合肽段的偏好性。
四、模型可有效预测肽段引发的T细胞活化反应
T细胞活化是衡量相互作用的核心指标，实验证实该模型能精准区分可激活T细胞的肽段，性能优于传统结构预测工具。研究筛选出多种新型自身抗原，其中部分肽段激活能力强于已知抗原。单独依靠MHC强结合能力无法实现T细胞活化，而源自PSG5的肽段契合病症发病部位，被证实是两类自身免疫病的全新候选抗原。
Fig.4是该研究的“验证闭环”，它从细胞功能、抗原反应、临床相关性和结构解析四个层面，验证了模型预测的候选自身抗原（特别是PSG5肽段）的生物学意义，同时证明了模型在预测T细胞活化上的优势：
功能验证：细胞实验证明，模型预测的肽段能有效激活T细胞。
性能碾压：模型在预测T细胞活化上，显著优于传统结构预测方法。
临床关联：发现并验证了与疾病（尤其是眼部并发症）相关的新型自身抗原PSG5。
结构支撑：晶体结构证明了模型预测的生物学合理性。
五、联合建模提升同谱系TCR的预测泛化能力
多种致病TCR可识别同一类抗原，说明它们拥有相似的作用机制。通过人工突变构建同源TCR群组，单模型在肽结合预测中表现稳定，但预测T细胞活化效果有限。将同谱系TCR数据整合后开展联合建模，模型预测能力得到显著提升，证明整合同源受体数据，能够更精准地识别可激活T细胞的活性肽段。
Fig.5聚焦于TCR模型的泛化能力与知识迁移，通过TCR19.2及其5种CDR3β突变体（C1-C5），系统验证了模型在局部“TCR邻域”内的预测规律：
序列≠泛化能力：TCR的微小突变会导致功能的显著变化，模型的泛化能力取决于TCR间的功能距离，而非序列相似度。
联合训练是关键：在功能相关的TCR邻域内进行联合训练，可以实现知识迁移，显著提升模型对边缘突变体的预测性能。
模型具备生物学意义：模型性能的变化，真实反映了TCR识别抗原的分子机制，为后续优化模型和理解TCR交叉反应提供了指导。
核心结论是：TCR之间的功能距离，而非序列相似性，决定了模型的泛化性能。
六、探究模型泛化边界，建立可靠性评估体系
探索模型对全新TCR的预测能力，提出功能距离才是决定预测效果的关键，而非基因序列相似度。团队引入马氏距离评估模型预测可靠性，该数值和实际功能差异高度相关。验证实验表明：新TCR与训练样本越相近，模型预测结果越准确，这套评估方式可有效指导后续TCR相关实验研究。
Fig.6阐明了模型对新TCR的泛化能力，核心发现是：TCR间的功能距离（肽识别谱差异）是预测模型泛化性能的关键指标，而非序列相似度。
序列相似度≠功能相似度：传统的序列编辑距离、TCRdist等指标无法反映真实的功能差异。
功能距离是关键：TCR间的JS距离（基于肽谱）与模型性能强相关，是衡量泛化能力的黄金标准。
马氏距离是可量化的工具：模型嵌入空间中的马氏距离，可以作为预测新TCR泛化难度的“置信度指标”。
性能差异体现在基序层面：模型性能差的本质，是未能正确捕捉TCR识别抗原的关键基序。
讨论
一、 搭建全新实验计算整合研究平台
搭建以肽识别全景图谱（PRPs）为核心的整合分析平台，结合高通量pMHC酵母展示技术与微调后的蛋白质语言模型。该平台能够高分辨率解析TCR序列与功能的内在关联，产出的数据集与预测模型，可为TCR特异性图谱绘制、疾病抗原挖掘、TCR预测泛化规则研究提供全新的技术支撑与研究思路。
二、明确TCR聚类规律与链功能分工机制
研究证实，即便受同种MHC基因限制，TCR也可依据肽识别特征形成不同功能聚类。明确TCRβ链主导核心抗原识别特异性，α链仅微调识别效果、调控免疫反应强度。基于PRP的分类方法，弥补了传统序列分组技术的不足，精准捕捉TCR与肽段相互作用的细微规律。
三、模型可突破结合层面，精准预测T细胞活化功能
该模型仅依靠肽结合数据训练，却能有效预测肽段诱导的人体T细胞活化反应，性能优于主流传统结构预测工具。模型可捕捉静态结构无法体现的构象动态、能量变化等关键信息，还成功筛选出强直性脊柱炎新型自身抗原PSG5，为自身免疫病的发病机制研究提供了新依据。
四、提出功能距离标准，优化TCR预测泛化能力
推翻仅靠序列相似度判断TCR功能的传统思路，证实TCR间的功能距离才是预测准确性的核心关键。研究引入马氏距离量化模型预测可靠性，可精准评估未知TCR的预测置信度。同时证实，同功能TCR邻域联合建模，能进一步提升模型对精细抗原识别的预测能力。
五、拓展TCR交叉反应性的研究认知
研究序列高度相似的TCR，其肽识别功能图谱也可能存在明显差异。这意味着在疾病相关TCR克隆研究中，无法单纯依靠序列相似度，判断TCR的分子模拟与交叉反应特性。
六、客观梳理研究存在的局限性
本研究仅聚焦单一MHC亚型的致病TCR，传统序列聚类工具在高相似TCR群体中分辨率不足。同时实验肽库的固定设计，虽提升了数据质量，但也限制了肽段筛选范围。研究团队已通过多类独立实验验证候选抗原，最大程度降低实验设计带来的结果偏差。
七、平台具备广泛的科研推广应用价值
尽管存在局限，这套整合研究平台通用性极强，可适配多种MHC基因亚型，也能应用于肿瘤、感染性疾病的免疫组库研究。模型可精准预测活化肽段并输出置信评分，能够指导TCR免疫治疗的精准设计，助力研发出特异性更强、安全性更高的工程化免疫受体。
本研究成功搭建了以肽识别为核心的TCR特异性研究框架，实现了TCR识别特性的精准定义与预测。这套全新的实验计算整合平台与配套数据资源，不仅深化了人类对适应性免疫的基础认知，也为免疫学研究与生物医疗技术研发提供了高效的新型工具。
艾沐蒽专注于免疫驱动医学领域多年，开发的ImmuHub®技术平台方法全面，检测物种多样，建库方法具有灵活性，致力于为各大高校、医院、科研机构、企业等提供优良的科研服务。
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