Nature揭秘免疫相关不良事件:BULK测序与单细胞测序双管齐下,揭示T细胞的独特特征

免疫相关不良事件 (immune-related adverse event, irAE)是指抗肿瘤药物/治疗临床试验中,经判定与免疫机制相关的所有级别的药物不良反应,不包括非特异输液反应。如何预防irAE或减轻irAE对器官的损伤程度是科学家们探索的方向,免疫组和转录组测序在irAE的相关研究中发挥了重要作用。

在发表于Nature Medicine的一篇文章“T cell characteristics associated with toxicity to immune checkpoint blockade in patients with melanoma”中,作者通过单细胞RNA测序、单细胞V(D)J测序、bulk RNA测序和bulk T细胞受体(TCR)测序的联合应用探索了与黑色素瘤患者免疫检测点阻断毒性相关的T细胞特征,研究发现治疗前外周血中的激活的CD4记忆T细胞丰度和TCR多样性与严重的irAE发生相关。

T细胞特征与黑色素瘤患者免疫检查点阻断的毒性相关

发表时间:2022年1月

影响因子:87.244

研究方法:①血液采集和处理 ②mass细胞术和流式细胞术 ③单细胞RNA-seq ④单细胞V(D)J测序 ⑤bulk RNA-seq ⑥bulk TCR测序 ⑦建立预测irAE发展的综合模型 ⑧自身免疫性疾病中循环白细胞组成的评估

研究结果
01
临床队列特征
纳入了71例转移性黑色素瘤患者,其中,33例患者采用抗pd-1单药治疗,38例患者采用抗pd-1和抗CTLA-4联合治疗。所有患者在免疫检查点抑制剂(ICI)治疗期间和治疗后均密切监测irAE的发展(中位随访时间为14.9个月;到3级+irAE的中位随访时间为1.5个月)。

将71个患者分为3个不相重叠的队列,一个单细胞研究队列和分为训练集和验证集的2个bulk队列(图1)。

图1

02

来自治疗前血液中的严重irAEs的决定因素

首先对单细胞研究队列中18例患者的治疗前外周血样本进行高维单细胞图谱分析(图2a),其中8例患者在治疗开始后出现严重的irAE。通过mass 细胞术(CyTOF)分析了20个不同的细胞亚群,包括7个主要的单核谱系(B细胞,浆母细胞,CD4和CD8 T细胞,自然杀伤(NK)细胞,自然杀伤T(NKT)细胞,单核细胞)的严重irAE结果(图2b,c)。

在所有亚群中,只有CD4效应记忆T(TEM)细胞在治疗前血液中较高的水平与严重的irAE发展相关(P = 0.0002;图2c,d)。

图2

然后通过scRNA-seq结合scV (D)J-seq对13例患者的外周血样本进行了检测。scRNA-seq得到了7个主要的细胞分类谱系,在7种细胞类型中确定了32种不同的转录状态(图3a)。在这32种细胞状态中,作者发现CD4 T细胞状态5缺乏CCR7和SELL(CD62L)的表达,与CD4 TEM细胞一致,与严重的irAE发育最为密切相关(图3b)。这种状态也与CyTOF测量的CD4 TEM水平最为相关(图3b)。进一步分析发现,CD4 T细胞状态3也显示了与CD4 TEM一致的表达谱(图3c)。当状态3与状态5结合时,所得到的聚类(CD4T 5 + 3)与严重的irAE发育和CyTOF所列举的CD4 TEM水平更显著相关(图3b)。

在经历严重irAEs的患者中,被激活的CD4T 5 + 3细胞的单细胞TCR克隆型多样性(香农熵)升高(受试者工作特征曲线下面积AUC= 0.90,P = 0.05;图3e)。这表明,在总的PBMCs中,激活的CD4 TEM细胞的TCR丰富度是注定要发生严重irAE的患者的治疗前TCR多样性总体增加的基础。

当结合所有可评估的T细胞时,治疗前样本中的TCR高多样性与严重irAE发育之间显著相关(AUC = 0.80;图3e)。这种关联主要归因于具有效应记忆谱的CD4 T细胞(低CCR7和SELL)(图3f)。

总的来说,这些发现表明,基线时bulk外周血中CD4 TEM细胞更多样化的TCR库,与严重ICI毒性的发展相关。

图3

03

irAE相关的T细胞特征的扩展分析

作者将bulk RNA-seq应用于另外53例转移性黑色素瘤患者的外周血样本,来验证上述发现。

在CIBERSORTx评估的13个PBMC亚群中,只有激活了的CD4 TM细胞水平与严重的irAE发育相关(图4a)。bulk外周血中较高的TCR克隆型多样性也预示着严重irAE的发展(图4b)。

鉴于这些结果,作者生成了一个整合这两个特征——激活的CD4 TM细胞丰度和整体TCR多样性的复合模型(图4c)。生成的复合模型在bulk队列1中产生AUC为0.85(P = 0.02),在bulk队列2中产生AUC为0.9(P =0. 0004),优于任何一个单独的特征。

接下来探索复合模型是否可以独立于关键的患者参数预测严重的irAE。发现,无论ICI治疗类型、ICI反应状态、年龄、性别、黑色素瘤亚型或受影响的器官系统如何,无论是在bulk队列2还是留一交叉验证(LOOCV)评估的两个bulk队列中,该模型仍然具有预测性(图4d)。

此外,在接受联合ICI治疗的患者中,复合模型在bulk队列1中产生AUC为0.2(P = 0.04),LOOCV 的AUC为0.86(P = 0.01),用于预测所有可评估患者的严重 irAE 发展(图4d)。

作者还探讨了模型性能作为irAE分级和器官系统受累的功能。尽管针对单一分类结果(严重与无严重irAE)进行训练,但是治疗前综合模型评分随着irAE严重程度而增加(图4e)。

为了测试治疗前复合模型是否能够预测严重irAE发生的时间,我们接下来通过在bulk队列1中定义一个最佳切点,将患者分为高组和低组。在bulk队列2中,高组患者在治疗开始后的1.74个月内经历了严重irAE,而低组的绝大多数患者从未经历过严重irAE(P < 0.0001,风险比(HR)= 11.6;图5a)。

图4

04

外周TCR克隆扩增与严重的irae相关

假设治疗前的外周血TCR克隆型在ICI治疗开始后注定会发展为严重irAE的患者中可能表现出更大的扩张倾向。为了验证这一点,作者分析从15名接受联合治疗的转移性黑色素瘤患者收集的配对治疗前和早期治疗的PBMC样本中的bulk TCR-ß库。

首先评估了治疗开始后的TCR克隆扩增(即克隆优势),与未发生严重irAE的患者相比,严重irAE患者的TCR克隆扩增和持续性T细胞克隆(定义为配对治疗前和治疗早期的血液样本之间共享的生产性TCR-β CDR3核苷酸序列)显著增加(图5b)。

在进行scRNA-seq和单细胞TCR测序(scTCR-seq)(n = 3)的严重irAE患者中,观察到通过scRNA-seq分析鉴定的CD4 T 5 + 3群体中,持续性的CD4 T细胞克隆高度富集(图5c)。

作者还探讨了治疗后早期TCR克隆扩增的程度是否与严重irAE发生的时间相关。发现,TCR克隆扩增程度较高的患者都会更早发生严重的irAE(P=0.003,图5d)。

图5

05

自身免疫性疾病中的循环白细胞

作者还探索了有严重irAE发展风险的患者的基线外周血图谱是否与临床自身免疫相似。应用CIBERSORTx检测了6项研究中bulk外周血转录组中的15个白细胞亚群,以及587例系统性红斑狼疮(SLE)或炎症性肠病(IBD)患者,以191名健康人作为对照组。与健康个体相比,循环中激活的CD4 TM细胞与自身免疫性疾病的相关性最为显著(图6)。这些数据表明,严重的irAEs可能代表一种亚临床或潜伏的自身免疫状态,在ICI给药中被掩盖。

图6

研究结论
基线外周血中激活的CD4 TM细胞丰度和TCR库克隆多样性有希望作为转移性黑色素瘤患者ICI诱导irAEs的决定因素。在接受联合治疗的患者中,治疗早期T细胞克隆扩增与严重irAE发病的时间之间存在惊人的相关性。

参考文献
Lozano AX, Chaudhuri AA, Nene A, et al. T cell characteristics associated with toxicity to immune checkpoint blockade in patients with melanoma. Nat Med. 2022 Feb;28(2):353-362. doi: 10.1038/s41591-021-01623-z. Epub 2022 Jan 13.

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