TCR测序应用 | 预测鼻咽癌过继性CTL治疗临床反应

在过去的十年中，过继性T细胞疗法在治疗各种类型的癌症方面取得了逐步和稳定的进展。作者在进行一项临床试验NCT00690872中，联合吉西他滨和卡铂化疗治疗EB病毒(EBV)阳性鼻咽癌(NPC)患者自体EBV扩增细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。虽然有62.9%的达到2年总生存率，但该试验确没有在一部分患者中产生诱导抗肿瘤反应。因此，仍然迫切需要的评估CTL产物和预测临床免疫治疗效果的基准，于是作者选择进行了T细胞受体(TCR)全库测序，来评估EBV扩增的输注完成的CTL产物。为了描绘整体的库景观，作者通过香农熵评估了个体库多样性，并比较了患者间CDR3相似性来估计由共同抗原扩增的T细胞。利用最近开发的一种称为Motif Analysis的生物信息学算法，对TCRβ CDR3内与CTL治疗预后相关的结构区域进行了机器学习预测。

结果表明，含有共同核心基序集的不同TCR序列与EBV阳性鼻咽癌（NPC）的CTL免疫治疗的有利反应有关。

下面就让我们了解一下！

研究方法

1.研究设计

2.TCR文库构建及TCRβ测序

3.原始数据（Raw data）处理

4.多样性分析

5.相似性分析

6.Motif 分析

7.统计分析

研究结果

作者首先测量了CDR3序列的多样性，并将MHC相互作用包括在内，测量了全长TCR。在个体水平上，虽然缺乏统计学意义，但观察到TCR多样性与患者总体生存率之间存在弱正相关(补充图2)。

图1.EBV特异性过继T细胞治疗的长期幸存者具有更高的TCR库多样性，没有HLA偏见

注：a.CDR3区域LTS与STS的Shannon熵比较。

b.全长TCR的Shannon熵比较。

c-h.子组中的香农熵比较。LTS和STS根据其HLA等位基因或类型进行分组。每个点代表每位患者CTL库的香农熵值。P值采用非参数Wilcoxon符号秩检验计算;*，p < 0.05。LTS，长期幸存者;STS，短期幸存者。

然而，在将患者分为STS组和LTS组后，在CDR3和全长测量中，输注到LTS的CTL具有明显更高的TCR多样性(图1a, 1b)。

尽管样本量限制了某些亚组的统计学意义，但对于几乎所有HLA在不同类型中，LTS组的TCR库多样性更高(图1c-h)，表明观察到的CTL库多样性缺乏HLA偏倚。总之，这些发现表明，在CTL生产过程中，多样化EBV特异性T细胞克隆的产生了可能有利于抗NPC的功效。

尽管多样性分析表明，可能不存在支配CLT抗肿瘤反应的显性EBV抗原，但尚不清楚在LTS中CLT是否针对一组共同的“有效”抗原提出。使用Jaccard指数分析，作者量化了组内和患者间TCR库的相似性。与STS组相比，LTS组患者间CTL CDR3相似性较低(图2a, 2b)，并且，当该分析扩展到整个TCR时，观察到相同的模式(图2c)。

作者还观察到，每个CTL产物的克隆频率分布在很大程度上偏向于高度扩增的克隆:：频率排名在前1%的克隆型累计占LTS库的90.10%(±12.85%)，STS库的96.83%(±1.41%)。对于样本间克隆型相似性测量，这种分布剖面可能低估了高频克隆的贡献。为了减轻这种偏见，作者评估了最普遍的克隆型之间的相似性。通过对前10%、前1%和前0.1%区间的最高频率克隆的调查，发现LTS(平均相似值为0.2292 ~ 0.0006)和STS(平均相似值为0.3868 ~ 0.0051)患者间TCR CDR3相似性逐渐降低，表明较高频率克隆对相似性的贡献更大。然而，与STS相比，在每个排名类别中，LTS组的CDR3共享率明显较低(图2d)。

总之，这些结果表明，在LTS中，输注的CTL细胞不太可能针对一组共同的表位扩增。与上述患者内部TCR多样性分析一样，这些患者间CDR3相似性分析也表明，共同的EBV抗原可能不是抗NPC CTL临床疗效的主要决定因素。

为了确定这种相似性分析是否受到组内HLA重叠的影响，作者检查了库相似性和HLA共享之间的相关性，三个等位基因检测I型HLA，个体间共有HLA等位基因数为0 ~ 6个。LTS组和STS组HLA复杂性无差异(图2e)。此外，无论HLA多样性如何，所有STS的CDR3共享率都高于LTS(图2f)。

为了进行Motif分析，作者将所有LTS中的所有CDR3克隆型汇集在一起，并通过去除重复序列生成唯一的CDR3列表。CDR3克隆型前10%的2mer、3mer和4mer连接氨基酸序列构成了初始基序库。计算LTS组和STS组间含有K-mer基序的CDR3的组内频率之和之比(LTS/STS)。然后，作者利用准确性算法来识别在LTS的CLT中优先富集的基序，其中准确性定义了输入变量预测结果的程度(图3a)。

当LTS/STS的比值大于10时，共有11个基序被鉴定为与总生存率非负相关(图3a, 3b)。

以这11个基序的存在和频率作为唯一的分组参数，作者将大多数患者分开以匹配他们的临床反应，只有3个LTS被错误识别(准确率为90.3%;图3c)，表明通过机器学习识别的CDR3基序可以有效地对受益于EBV-CTL治疗的NPC患者进行分层。近年来，许多EBV特异性TCR被功能验证并存入公共数据库，如VDJdb和McPAS-TCR。

作者将所有这11个与反应相关的主题提交到这两个数据库中进行搜索。在抗EBV抗原表位的TCR(s) CDR3区成功发现了DGAG、EES、EVAG、GSRS、KTGE、LYL、SPFS和TTNT 8个基序。这些表位分布在BMLF1、BRLF1、EBNA和BZLF1蛋白上(图3d)。这支持了一种观点，即这些基序属于在生产过程中被EBV抗原扩增的CTLs。

接下来，作者利用机器学习进一步对这11个CDR3基序的重要性进行排序。为每个motif生成两个独立的精度参数：mean reduction accuracy和mean reduction Gini。前者假设关键变量的排列会降低模型精度，通过对每个变量进行排列来计算精度变化。后者构建单个决策树，然后测量每个变量的节点杂质的平均总减少。两种方法都确定了相同的两个4mer基序，SPFS和SPDQ，它们对所有患者的反应预测准确性贡献最大(图3e)，这两个基序在LTS CTL的TCR中都显著富集(图3f)。对其他9个基序的频率比较也发现LTS组的基序SERR丰富(图S3a)，尽管其对预测精度的影响较低(图3e)。作为生物标志物评价，ROC分析得出SPFS和SPDQ的曲线下面积(AUC)分别为89.1%和84%(图3g)。

对于个体患者而言，SPQD基序的累计CDR3频率与LTS患者的总生存率呈正相关(图3h和图S3b)。此外，这两个基序在HLA等位基因为A2、A11或B46的LTS中显著富集(图3i)。总之，这些结果表明，在输注的CTL的CDR3区域内特异性基序的富集可能预测鼻咽癌患者对EBV-CTL治疗的反应。具体来说，通过数据库搜索，确定SPFS基序属于识别BLZF1蛋白中RAKFKQLL表位的TCRs(图3d)。实验中，HLA-B*08:01呈递了该表位。虽然在基序分析中没有发现任何患者的HLA- b *08:01，但我们使用NetMHCpan4.141和HLAthena42算法评估了其他HLA等位基因是否可能存在该表位。这些生物信息学工具预测RAKFKQLL表位可能存在HLA-A*33:03、B*15:01、B*15:25、B*38:02或B*46:01，具有足够的亲和力。在我们的队列中，31例患者中有27例至少含有一种HLA等位基因(表S4)。因此，对于作者的队列，RAKFKQLL表位在肿瘤组织中的呈现是可能的。这意味着CTL产物中含有SPFS的TCRs可能提供临床观察到的有益成分。

总结

EBV阳性鼻咽癌细胞表达EBNA1、LMP1、LMP2等几种通用病毒抗原，可有效靶向清除肿瘤细胞。多项临床研究表明，含有LMP2特异性反应性的EBV富集CTL与客观反应相关。尽管生存分析显示总生存率显著提高，但通过ELISPOT分析，输注CTLs中LMP2特异性T细胞的频率无法预测个体的抗肿瘤反应。在这里，通过深度测序进行了高通量TCRβ库分析，以深入了解EBV-CTL库的特征。发现LTS具有较高的患者内部TCR库多样性和较低的患者间相似性。使用新开发的Motif Analysis算法，确定了11个能够区分LTS和STS的Motif，这些Motif可能最终用作临床疗效的预测因子。

作者的研究提出了一种新的方法，通过与NPC患者生存相关的CDR3识别基序对体外生成的EBV-CTLs进行分层，以优化治疗建议。