Current Opinion in Immunology最新发表| TCR 测序作为癌症免疫治疗biomarker应用

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【背景介绍】

T细胞受体 ( TCR ) 测序是一种可以表征抗肿瘤免疫反应的深度、强度和动态监测的强有力的工具。

二代 (NextGen) 测序技术和相关⽣物信息学流程的进步显着提⾼了TCR 库研究的灵敏度、准确性和定量限，从⽽产⽣了⼤量的出版物和相关数据集。

然⽽，在从TCR库的静态快照中推断动态和抗原特异性方面仍然存在重大的计算挑战。

在这⾥我们回顾了应⽤ TCR 库分析来跟踪宿主对免疫治疗检查点阻断的免疫反应方面的进展。在不断变化的肿瘤微环境中跟踪反应的演变和异质性，并揭示T细胞抗原特异性。

·T 细胞克隆性和多样性作为评估 TCR 对免疫检查点抑制剂反应的指标

在这篇综述中，我们重点关注alpha 和 beta TCRs。

TCR 基因是在 T 细胞分化过程中通过随机和不精确的体细胞重组短同源基因组序列集 V、D 和 J 基因⽽产⽣的。由于可能性TCR alpha/beta 异⼆聚体的总数是巨⼤的^[1] ，同⼀序列很少在⼀个个体中产⽣两次，因此多次观察到的相同序列很可能是通过单个T细胞克隆的选择和增殖得到的。

TCR 库的总体克隆性^[2] 是⼀种指标，⽤于捕获在样本中多次观察到的TCR的数量和频率，通常⽤作免疫活性的指标（图1）。

TCR库多样性与克隆性成反⽐，并捕获库的⼴度。⼏个⼩组研究了免疫检查点阻断对T细胞克隆性和多样性的影响。鉴于获得纵向肿瘤样本的挑战，这些研究中的⼤多数都使⽤了外周⾎采样。在膀胱癌患者中，尿液衍⽣淋巴细胞 (UDL) 可能提供⼀种额外的⾮侵⼊性 TCR 库测序⽅法^[3]。

在晚期⿊⾊素瘤患者中，CTLA-4抗体治疗后 TCR库多样性增加^[4]。

这种增加的多样性被假设反映了新肿瘤反应性克隆的募集，正如CTLA-4治疗后新检测到的CD8+⿊⾊素瘤特异性TCR数量增加所表明的那样^[5]。

令⼈惊讶的是，对TCR库的系统影响似乎⾮常有限。也许体内达到的浓度⾜以对整个免疫系统产⽣的影响（⾎液、胸腺等）相对有限，并且仅限于调节性 T 细胞在限制免疫反应⽅⾯最活跃的地⽅（例如在肿瘤中）。

然⽽，外周⾎T细胞多样性的增加也与 CTLA-4 毒性有关，这表明检查点抑制也可能导致⾃⾝反应性T细胞的募集^[6]。

相⽐之下，在或治疗之前^[7]或之后^[8]增加的库克隆性与改善 CTLA-4 治疗的反应和⽣存相关。

因此，TCR库分析⽀持这样⼀种观点，即强⼤的预先存在的免疫⼒，例如增加的 T 细胞克隆性，以及CTLA-4诱导的T细胞库扩⼤是提供有效免疫治疗反应的关键（图2a）。

与 CTLA-4 相似，治疗前克隆性的增加与⿊⾊素瘤抗 PD1 治疗的临床结果改善有关^[9,10]。此外， PD-1 治疗后 T 细胞克隆性增加与转移性⿊⾊素瘤、NSCLC、胶质⺟细胞瘤和转移性膀胱癌的临床反应相关^{[9,11,12,14,17]}。

有趣的是，在“治疗中”肿瘤样本中检测到的 T 细胞克隆性增加主要是单药 PD-1 治疗的特征，⽽不是那些接受双重 PD-1/ CTLA-4 抗体治疗的特征。

因此， PD-1 可能有利于现有抗肿瘤 T 细胞的维持和扩增（图2a）。

然⽽，新型 T 的寡克隆扩增在⽤ PD-1 治疗的基底细胞癌和鳞状细胞癌中观察到细胞克隆型，这表明在某些情况下，预先存在的肿瘤浸润性淋巴细胞 (TIL) 的恢复能⼒可能有限，并且肿瘤内 T 细胞对检查点阻断的反应可能是由于最近进⼊肿瘤微环境的 T 细胞克隆的独特库集^{[13 ]}。外周⾎中 T 细胞区室的功能异质性使迄今为⽌报道的所有研究的解释变得复杂，使⽤富含抗肿瘤 T 细胞（例如 CD8+ PD1+ ）的细胞表⾯标记物对分级 T 细胞进⾏更详细的分析是⼀个领域的积极研究。 

然⽽，有令⼈信服的证据表明，TCR 库的克隆性和多样性反映了对检查点抑制剂的治疗反应，提供了对作⽤机制的深⼊了解，并⽀持使⽤ TCR 库分析作为分层和监测免疫治疗患者的⽣物标志物。

肿瘤异质性由肿瘤进化过程中的遗传和表观遗传变化引起，是许多癌症公认的重要特征，对疾病进展有重⼤影响^[14]。

肿瘤异质性与宿主免疫的关系免疫反应是复杂的，因为免疫反应是驱动免疫进化的强⼤选择⼒，但基因组不稳定性也会产⽣新抗原，从⽽驱动具有重要临床相关性的免疫反应。例如，研究表明，克隆性⾮同义突变的⾼负担与疾病复发减少和对检查点封锁的反应改善有关。⽐较来⾃不同肿瘤样本的 TCR 库的⼀个关键混杂因素是在核酸提取、PCR 扩增和测序过程中在核酸提取、PCR扩增和测序过程中取样时产生的异质性。因此，重要的是建⽴⼀个严格的统计框架来控制抽样过程。

在早期 NSCLC 的背景下，我们开发了这种统计上严格的⽅法，并⽤它来定义普遍存在的 TCR，存在于整个肿瘤中，以及区域性 TCR，仅存在于肿瘤的特定区域^[18]。

普遍存在于肿瘤的多个区域或多个转移性病灶中的 TCR 可能代表对所有癌细胞中发现的常⻅肿瘤抗原的反应，尽管这⼀假设的直接实验证据仍然有限。由于新抗原可在肿瘤演化过程中逐步出现，因此肿瘤不同区域的新抗原数量可能存在较⼤差异。我们之前曾报道，在肿瘤的不同区域也可以观察到不同的 T 细胞克隆型，并且扩增的 T 细胞克隆中的空间异质性与空间突变异质性相关（如图2b 所⽰）。

这些发现，以及⼤量关于原发性肿瘤^[19‒21]和转移性肿瘤^[22‒24]中 TCR 异质性的进⼀步报道，⽀持了这样⼀种观点，扩大的肿瘤内T细胞克隆是由肿瘤内新抗原情形驱动的，这些情形可能是由体细胞突变和包括局灶性HLA缺失或抗原处理缺陷在内的免疫编辑所造成^[15,18]。

此外，纵向样本中库的异质性可能反映了宿主-肿瘤关系的动态变化^[18]。

将新抗原或肿瘤相关抗原特异性分配给 TIL 是⼀个关键领域，既可以提⾼我们对适应性抗肿瘤免疫反应的理解，也可以将这些知识转化为治疗（图2c）。

TIL 群体中序列相关 TCR 簇或⽹络的鉴定^[18]提供了抗原特异性的有⼒间接证据^[25] （图3a）。TCR 测序结合体外肽刺激（特定 T 细胞的突变相关新抗原功能扩展 (MANAFEST) ^[26]测定）和/或 MHC 肽多聚体分选^[18]与单细胞RNA测序 (scRNAseq) 提供了直接探索淋巴细胞抗原特异性的有效平台。与批量测序相⽐，scRNAseq 识别 alpha/beta 基因对，因此可以更完整地表征与每个 T 细胞相关的 TCR 受体。

此外，将 TCR 测序与全局 scRNAseq 相结合，将 T 细胞受体与 T 细胞的转录状态联系起来^{[ 27,28,29 ]}。⼤多数以这种⽅式鉴定出抗原特异性 TCR 的研究都集中在 TIL 上，因为它们可能⾼度富集了肿瘤反应性 T 细胞。然⽽，在⼀个⽰例中，TCR 库分析表明，在外周⾎中从 PD-1 阳性 T 细胞扩增的 T 细胞中检测到⼤约11% 的肿瘤驻留 T 细胞克隆^[30]。因此，也可以使⽤更容易获得的外周⾎ T 细胞库进⾏抗原特异性研究。

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