Nature|揭示新抗原T细胞在肿瘤治疗中的免疫反应

免疫疗法的开发为癌症治疗带来革命性的影响，其中像是抗PD-1、PD-L1抗体等免疫检查点抑制剂已成为许多癌症的一线疗法，然而至今仍有许多病患对此类疗法并不产生应答。

近日，加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心（UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center ）的一个研究小组首次确定并分析了免疫细胞如何“看见”癌细胞并产生相关反应，这将有助于解释免疫检查点抑制剂背后的耐药机制，并为不应答患者开发相对应的个体化免疫癌症疗法。研究论文“Neoantigen-targeted CD8 T cell responses with PD-1 blockade therapy+”发表在知名期刊《Nature》上。

新抗原（neoantigens）是源自人类白细胞抗原（HLAs）呈现的非同义突变的肽，其被抗肿瘤T细胞识别。大量的HLA等位基因多样性和有限的临床样本限制了对患者治疗过程中新抗原靶向T细胞反应的研究。

基于此，美国加州大学洛杉矶分校Antoni Ribas教授应用最近开发的技术，对接受抗程序性死亡受体1（PD-1）“检查点抑制剂”免疫治疗的转移性黑色素瘤患者的免疫反应进行了前所未有的观察。这种技术能够自血液与肿瘤中识别并分离对癌细胞突变有反应的T细胞（即那些能够辨认neoE的细胞）并对其所辨认的突变蛋白序列进行分析，因此科学家能够获得患者体内癌细胞突变种类、产生抗肿瘤反应的T细胞种类、数量等信息。

研究者生成了个性化的新抗原-HLA捕获试剂，以单细胞分离T细胞并克隆其T细胞受体(neoTCRs)。具有不同neoTCR序列的多个T细胞(T细胞克隆型)在7名具有长期临床反应的患者的样本中识别出有限数量的突变。随着时间的推移，在血液和肿瘤中反复检测到这些neoTCR克隆型。来自4名对抗PD-1无反应的患者的样本也显示，血液和肿瘤中的新抗原特异性T细胞对有限数量的低TCR多克隆性突变有反应，并且在后续样本中未反复检测到。使用非病毒CRISPR-Cas9基因编辑在供体T细胞中重建neoTCRs，证明了对患者匹配的黑色素瘤细胞系的特异性识别和细胞毒性。因此，有效的抗PD-1免疫治疗与肿瘤中多克隆CD8+ T细胞的存在和血液特异性的有限数量的免疫显性突变有关，这些突变随着时间的推移被反复识别。

图1. 新抗原特异性T细胞筛选和TCR克隆型鉴定

研究者对11名接受PD-1阻断免疫治疗的转移性黑色素瘤患者的样本进行分析，其中患者1到患者7从免疫治疗中获得了持久的益处，生存时间在32个月到111个月之间，而且到本研究结束时所有患者依然存活；患者8到患者11，对免疫治疗没有反应，或者治疗后病情加重，在研究结束时这些患者都已去世。虽然所有患者肿瘤中所含突变数差距极大（突变数范围31-3507），能够为T细胞所辨认的突变却不多（突变数范围：1-13）。对从血液和肿瘤中分离的新抗原特异性T细胞的单细胞TCR测序显示，应答患者体内所具专一辨认neoE的T细胞种类多元，研究人员能够分离出多种不同的T细胞（T细胞种类范围：7-61），相反地，不应答患者中仅有能够辨认少数neoE的T细胞（T细胞种类范围：2-14）。

此外，研究者还发现，应答患者都可以在血液或者肿瘤内部持续分离出那些能够识别肿瘤突变的T细胞，相反地，不应答患者体内无法反复侦测到这类T细胞。

图2. 从TILs和PBMC中分离出对抗PD-1治疗有反应的患者的新抗原特异性T细胞

研究者对每个患者所有可用的PBMC和TIL样本进行了新抗原识别的纵向分析。患者1的淋巴结和头皮皮下组织有持久的反应（图2a,b）。在来自患者1的黑色素瘤细胞系中，共鉴定出3507个体细胞编码突变，其中1243个被预测为通过RNA-seq表达。一个包含243个新抗原-HLA盖帽试剂的文库，涵盖了6个患者HLA I类的186个突变，并用于从血液和肿瘤样本中筛选CD8+ T细胞（图2c）。总共分离出了571个新抗原特异性T细胞，包括41个不同的neoTCR克隆型和11个靶向突变。在分离出新抗原特异性T细胞后，选择22个neoTCR进行TCR克隆，在健康供体T细胞中表达和特异性新表位-HLA结合验证。这22个neoTCRs存在于482个新抗原特异性T细胞中，并针对9个不同的突变。识别NUP188、UBE2J1和WDR1三个突变新抗原的neoTCR克隆型在不同时间点反复出现（图2c）。在不同T细胞频率的血液和肿瘤样本中检测到22种不同的neoTCR克隆型，其中一些在不同时间点扩张或收缩。注意，外周血抽取在5毫升到20毫升之间，肿瘤活检是核心针活检，在任何时间点，每个腔室只采样少数T细胞。类似的结果在患者2和患者6的样本中也很明显，他们分别对抗PD-1治疗在肺部（图2d,e）和淋巴结转移（图2g,h）有长期的反应。患者2的自体细胞系有2562个非同义突变，其中1099个表达。患者特异性文库包含243个盖帽试剂，涵盖由3个患者HLAs呈现的180个突变。针对4种突变，分离出了21种不同的neoTCR克隆型。总共选择了19个neoTCR克隆型进行TCR克隆、在健康供体T细胞中表达和特异性新表位-HLA结合验证；其中14个已证实。共分离出186个新抗原特异性T细胞，包括这14个不同的neoTCR克隆型中的1个，靶向3个突变（图2f）。在患者6的308个体细胞编码突变中，表达了126个。患者特异性文库包含176个捕获试剂，涵盖80个突变，由6例患者的HLA I类分子呈现。总共分离出51个针对6个突变的不同neoTCR克隆型。其中，27个克隆型在健康供体T细胞中克隆并表达，其中21个被新表位-HLA结合进行了验证。在296个分离的新抗原特异性T细胞中鉴定出这21个neoTCR克隆型，并靶向5个突变（图2i）。对于对治疗有反应的患者3，4，5和7，自体细胞系呈现788（患者3），380（患者5）和177（患者7）个非同义编码突变，患者4的肿瘤活检显示506个体细胞编码突变。在这些突变中，分别表达了375、178、164和56个。患者特异性文库包括156、133、176和85个捕获试剂，分别涵盖100、79、80和32个突变。从这些患者中，分离出了55、24、7和61个neoTCRs，分别针对13、3、6和8个突变。

图3. 从TILs和PBMC中分离出新抗原特异性T细胞，以及对抗PD-1无反应的患者中的新抗原特异性T细胞抗肿瘤活性

研究者对抗PD-1治疗无应答的患者的新抗原特异性T细胞反应进行了表征（患者8至11）。患者8的活检有977个非同义突变，其中297个表达。分离文库包含196个捕获试剂，针对6个HLA I类分子的141个突变。该文库用于从基线和治疗中的PBMC中捕获新抗原特异性T细胞。总体而言，在治疗后的的PBMC样本中，发现了针对NES、CTNNB1、POLR2G和SERPINH1的突变的8种neoTCR克隆型，但在基线时没有发现新抗原特异性T细胞。来自患者9的黑色素瘤细胞系有193个非同义突变，其中61个表达。组装了一个包含172个捕获试剂的文库，涵盖了由6个HLAs I类所呈现的71个突变。针对4个不同的突变，分离出5个新抗原特异性T细胞的neoTCR克隆型。值得注意的是，某些评估的突变没有通过测序检测到mRNA表达。新抗原-HLA多聚体结合的特征化只验证了四分之一的血液或肿瘤样本中分离出的一种neoTCR克隆型，该克隆型针对由HLA-C*05:01呈现的GSTCD突变（图3a)。来自患者10 （M485）的黑色素瘤细胞系有71个非同义突变，其中33个表达。制备了涵盖由5种HLA呈现的36个突变的132个新抗原- HLA捕获试剂库，并用于从基线血液和肿瘤样本中捕获新抗原特异性T细胞。从针对ACER3中相同突变的血液中捕获两种不同的neoTCR克隆型T细胞，其被预测由HLA-A*03:01呈现，并通过RNA-seq测量显示表达（图3b）。两种neoTCRs都通过新抗原-HLA特异性结合进行验证。患者11（M486）的黑色素瘤细胞系共有31个非同义突变，其中20个表达。文库包含17个捕获试剂，涵盖由3个HLA I类分子呈现的7个突变。研究者分离出了涵盖5个突变的14个neoTCR克隆型。其中，针对PRELP和MSI2突变的两种新抗原特异性T细胞克隆型与新抗原-HLA复合体的特异性结合已被证实（图3c）。总之，对抗pd-1治疗无应答的患者的突变新抗原特异性T细胞反应通常不是多克隆的，并且在不同时间采集的血液和肿瘤样本也不经常出现。

研究结果表明，肿瘤的新抗原特异性免疫反应针对黑素瘤中有限数量的免疫显性突变(范围3到13)，与肿瘤突变负荷和免疫治疗的临床反应无关。无论如何，在对抗PD-1有长期临床反应的患者中，新抗原特异性T细胞反应是多克隆的，随着时间的推移，多个新抗原特异性TCR克隆型(范围1到23)反复针对相同的突变，并在血液和肿瘤中检测到。这些结果表明，自然T细胞反应通过靶向数量非常有限的不同T细胞克隆型突变来清除肿瘤，其中一些细胞识别不同的HLA-新表位复合物，呈现相同的非同义突变。无论如何，研究者不能排除T细胞靶向非突变的肿瘤相关抗原(如黑素体分化抗原)在整体抗肿瘤反应中的作用。

“这项研究显示，对疗法不产生应答的患者体内，其抗肿瘤T细胞反应仍受到激发，”论文的第一作者，也是UCLA的助理教授Cristina Puig-Saus博士说道，“也许我们能够通过分离这些T细胞，并对其识别突变的T细胞受体（TCR）进行分析，根据所获得的信息对大量T细胞进行基因修饰，使得这些细胞能够专一识别患者肿瘤。最终通过体外扩增这些细胞，并输回患者体内来治疗患者。”

参考文献：

Puig-Saus C, Sennino B, Peng S, Wang CL, Pan Z, Yuen B, Purandare B, An D, Quach BB, Nguyen D, Xia H, Jilani S, Shao K, McHugh C, Greer J, Peabody P, Nayak S, Hoover J, Said S, Jacoby K, Dalmas O, Foy SP, Conroy A, Yi MC, Shieh C, Lu W, Heeringa K, Ma Y, Chizari S, Pilling MJ, Ting M, Tunuguntla R, Sandoval S, Moot R, Hunter T, Zhao S, Saco JD, Perez-Garcilazo I, Medina E, Vega-Crespo A, Baselga-Carretero I, Abril-Rodriguez G, Cherry G, Wong DJ, Hundal J, Chmielowski B, Speiser DE, Bethune MT, Bao XR, Gros A, Griffith OL, Griffith M, Heath JR, Franzusoff A, Mandl SJ, Ribas A. Neoantigen-targeted CD8+ T cell responses with PD-1 blockade therapy. Nature. 2023 Mar 8. doi: 10.1038/s41586-023-05787-1. Epub ahead of print. PMID: 36890230.

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