艾沐蒽ImmuHub®技术平台实现多物种免疫组库测序

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免疫组库（ImmuneRepertoire，IR）指在任何指定的时间，某个个体循环系统中所有功能多样性的B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T淋巴细胞和B淋巴细胞表面上都存在受体分子，分别称为T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR），其与机体的免疫状态息息相关。

不同物种的免疫组基因测序

目前，人和小鼠的Ig和TR序列信息注释完全、引物设计成熟，免疫组库测序在人和小鼠物种中的引用十分广泛。

但是艾沐蒽ImmuHub®基于研究需求打破了人源测序局限，基于RNA+5’Race单对引物建库法为不同物种和不同基因座的建库提供了成熟的技术方法。

目前ImmuHub®可服务的物种除了人和小鼠，还包括兔、鸡、食蟹猴、大鼠、蝙蝠和猪。若遇其他物种样本，也可联系艾沐蒽进行研发评估。

▲ 图1.适用的免疫组基因座

RNA+5’Race建库方法

目前，艾沐蒽ImmuHub®免疫组文库构建平台可根据不同样本类型和研究需求为客户提供个性化的文库构建和测序模式，通常使用5’Race或多重PCR文库构建方法。

▲ 图2. ImmuHub®技术路线
对于动物物种，首选推荐RNA+5’Race方法。采用此方法，不仅可以杜绝PCR扩增和测序错误，减少引物偏好性，而且可扩增VDJ全长，得到C区亚型，获得更全面的信息。

▲ 图3. 建库方法优劣势比较

01

引入UMI技术，杜绝PCR扩增和测序错误

基于5’Race原理，引入UMB（Unique Molecular Barcode，独立分子条形码）进行文库构建。每个样本检测中，在原始RNA模板扩增前加入的UMB种类可高达约1700万种，这可对后续PCR扩增或测序过程中的错误进行有效纠正，还原真实的数据，有效杜绝PCR扩增错误和测序错误，从而提高结果准确率。
▲ 图4. 基于UMB的纠错
引入UMB技术有两个优势：
（1）通过将具有相同UMB的reads聚集在一起可以有效矫正PCR扩增和测序错误，避免由于实验误差产生的新序列，解决了假高多样性（图5）；

▲ 图5. UMB技术修正了PCR扩增和测序错误，还原真实的免疫组多样性（蓝bar），避免了假高多样性（红bar）
（2）通过计数每种UMB的数目可以还原PCR扩增前的真实RNA序列比例，更真实地反应样本单克隆T/B细胞的情况（图6）。

▲ 图6. UMB技术消除PCR扩增序列，还原了PCR扩增前的真实单克隆T/B细胞比例（蜗牛图中1的部分）

02

减少引物偏好性

多重PCR引物建库法因同时进行几十对引物的扩增，体系异常复杂，且多种引物扩增效率可能存在偏倚，难以等效扩增，即使再优化调整，也无法和单对引物的等效扩增相比。而5‘RACE单对引物建库因仅采用一对引物进行扩增，可有效减少PCR扩增偏好性。

在某些样本中，用多重PCR引物扩增方法，就极容易扩增出来某一种的V基因片段，表现为样本中频率最高的V基因片段都相同，而用5’RACE的方法可以看到这些不同样本中频率最大的V基因片段都是不同的。
▲ 图7. 引物偏好性

03

可扩增出VDJ全长信息

5’Race单对引物建库法能够得到包含完整TCR/BCR，这意味着可以保留完整的V基因序列，即可以扩增VDJ全长序列。此种方法能够匹配多种不同测序模式，PE150/PE250/PE300均可。

▲ 图8. 5’RACE单对引物建库与多重PCR引物建库扩增区域

04

获得C区亚型信息

5’Race单对引物建库法根据C区设计引物，可得到C基因信息，如对BCR测序，还可得到IgH isotype信息，如IgA/M/G/D/E。

 

不同物种的免疫组测序可以为动物模型研究和动物传播人类疾病（如禽流感）相关疫苗研发提供重要生物信息。如对VDJC采取大片段原位替换人源抗体基因序列或删除部分C序列后的小鼠，艾沐蒽都能基于ImmuHub®技术实现个性化研发并获得全面VDJC信息，应用于全人单克隆抗体药物研发、 双/多特异性抗体药物研发、纳米抗体药物研发等多元化的新药研发。

 

 

参考文献：http://www.immuquad.com/publications/