TCR测序在肿瘤免疫治疗中的应用

T细胞是适应性免疫系统的组成部分，它们的反应是由独特的T细胞受体(TCR)介导的，TCR可以识别来自各种生物环境的特定抗原。因此，分析T细胞库可以更好地理解免疫反应和癌症等疾病。

二代测序技术极大地实现了TCR库的高通量分析。基于过去十年在该领域的丰富经验，作者提供了TCR测序的概述，从最初的文库准备步骤到测序和分析方法，最后到功能验证技术。关于数据分析，作者详细介绍了TCR库的重要指标，并提出了几种预测抗原特异性的计算工具。

最后，强调了TCR库分析在了解肿瘤生物学和开发癌症免疫治疗方面的重要应用。

TCR是高度多样化的异二聚体表面受体，使T细胞能够提供针对各种不同病原体的保护,功能性TCR由两条配对的蛋白链组成，其中有α链和β链，或γ链和δ链(图A)。

大多数T细胞TCRαβ链能够识别在MHC蛋白上呈现的抗原(3)。只有1%-5%的T细胞TCRγδ链表达不受MHC限制，参与先天免疫应答。目前尚不清楚T细胞结合的确切配体(5)。由于这些原因，αβ型TCR通常是TCR测序和后续临床应用的重点。

无论那种类型，TCR链都包含一个能够识别抗原的N端可变区和一个C端恒定区。可变区由可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因片段通过有序的V(D)J重组过程组装而成，其中每个基因片段的一个等位基因与其他基因片段的等位基因随机重组，形成功能性抗原识别区(图B)TCRα和γ链由V和J基因片段组成，而TCRβ和δ链还包括D基因片段，结构更加多样化。基因片段的整体组合多样性伴随着连接多样性，这是由基因片段之间连接处核苷酸的随机添加或删除所决定的。组合和连接的多样性赋予T细胞大量的抗原特异性，可能占10¹⁵到10²⁰个TCR链(8)。

每个TCR链的可变结构域有三个互补决定区(CDR): CDR1、CDR2和CDR3。CDR1和CDR2，由V基因片段编码，主要通过与MHC的保守a-螺旋接触促进TCR和MHC之间的相互作用。CDR3是由V和J或D和J基因片段的之间编码，导致了高变异性。该区域负责结合MHC呈递的抗原肽(8,10)。由于其与抗原的直接相互作用和固有的高变异性，CDR3区为TCR的特异性提供了丰富的多样性，因此是TCR测序常用的靶点区域。

TCR特异性是利用TCR测序来了解T细胞生物学和动力学，以及研究疾病背景下的T细胞和为治疗方法的发展提供信息的基础。虽然相同的TCR可能更倾向于识别相同的抗原，但也观察到存在交叉反应性，其中单个TCR具有识别多个pMHC对的能力(14-16)。因为TCR的交叉反应性有可能使T细胞群的表征和监测复杂化，因此在分析TCR测序和验证抗原特异性时，这一点不容忽视。

1.文库制备及测序方法

多重PCR和5’RACE建库

在T细胞库制备过程中，有两种常用的靶向扩增方法分别是多重PCR和5’RACE ,这两种方法通常主要扩增TCR的CDR3区域。

多重PCR引物建库：

多重聚合酶链式反应被广泛应用，它涉及使用J基因片段等位基因引物或TCR恒定区引物与已知V基因片段等位基因的混合物结合扩增CDR3区域的gDNA或RNA。从本质上讲，多重PCR受到可用引物的限制;正因为如此，新的V等位基因不能被准确地表达。此外，多重PCR中的引物偏置会导致等位基因扩增不均匀，导致不准确的相对TCR序列频率(8)。通过设计修改双条码和UMI有助于去除PCR扩增过程中引入的产物，并支持准确的下游序列分析。

5’RACE单对引物建库：

5’RACE利用RNA，只使用一对引物对靶向TCR链的恒定区域和mRNA5’端，这消除了多重PCR所带来的偏差，并允许捕获给定样品中存在的所有TCR。

bulk测序和单细胞测序

关于测序方法，bulk测序或单细胞测序可用于分析T细胞库。

bulk测序：

它对样本中未配对的TCR链的聚集进行测序，通常用于分析大规模TCR多样性并比较患者队列中的人群(8)。从历史上看，批量分析方法主要集中于TCRβ链(或δ 、T细胞中的γδ)的测序，因为与α链相比，存在额外的D基因片段和更大的组合多样性。此外，T细胞参与“等位基因排斥”，在这种情况下，T细胞中只有一条功能性β链存在，而多条α链也可能表达(27)。然而，仅对β链进行测序的一个主要限制是它不能提供关于β链配对或测序后T细胞体内生物学功能的信息。

单细胞测序：

单细胞测序侧重于单个免疫细胞。单细胞分离技术的进步，如荧光活化细胞分选和微流控平台，为单细胞TCR测序的成功奠定了基础(28)。虽然bulk测序提供了TCR多样性的宝贵信息，但它缺乏单细胞分析全TCRαβ链配对的分辨率。

单细胞测序提供了对T细胞库更有针对性和特异性的分析，提供了配对α链和β链序列的重要信息;然而，这种方法受到可以从给定样品中处理的细胞数量的限制，并且可能无法检测到罕见的克隆型。总的来说，通过分析单个细胞中的基因表达，单细胞分析可以更深入地了解细胞间遗传多样性和体内生物学功能。

2.分析方法

TCR库的指标特征

(图2A)T细胞密度，多样性和克隆指标展示T细胞库的特征。高指标与低指标对比，颜色代表不同的T细胞克隆类型。密度是指T细胞在给定区域的比例，多样性是指样品中独特克隆型的数量，克隆性是指样品中克隆型的扩增。

除了报告单个样本属性的指标外，还有一些指标有助于比较不同样本之间的T细胞库。常用的两个相似度指数是Jaccard指数和Morisita重叠指数(MOI)。Jaccard指数和Sorensen指数等相关指数仅基于多个样本中是否存在特定的TCR序列。这些方法在比较时很有用但无法比较样本之间特定TCR序列的相对频率。相比之下，MOI解释了相对频率以及特定TCR序列的存在，提供了来自不同样本的T细胞库的更全面的比较(图2B)。

克隆型(A)、克隆跟踪图(B)、维恩图(C)、差异丰度图(D)、热图(E)、系统发育树(F)、冲积图(G)和网络图(H);均用于表示TCR数据。这些图表提供了关于T细胞克隆型在不同患者、不同组织类型、不同疾病或治疗条件下的频率和进化的信息。

克隆跟踪和差异丰度分析可以快速识别纵向样本中扩增和收缩的T细胞群，使研究人员能够监测和预测在疾病和治疗过程中的免疫反应。

TCR和抗原数据库

这些数据库是许多计算工具的基础，用于分析TCR库和免疫反应的重要方面。

预测抗原特异性的计算工具

不仅通过特定指标描述T细胞库的功能，TCR测序还为确定T细胞抗原特异性提供了信息。这些信息可以帮助我们更好地了解个体内T细胞对具体抗原的反应情况，从而更好地理解和治疗某些疾病。同时，这些信息也为设计定制的免疫治疗方法提供了基础。在癌症免疫学领域，识别和靶向由癌细胞特有的体细胞突变产生的新抗原和肽让人们重视起来(64)。随着最近HTS技术的进步，包括作者自己在内的许多团队已经开发出基于机器学习和基于算法的工具，旨在阐明抗原特异性(表3)。

3.TCR测序在癌症中的应用

肿瘤特性的表达

TCR测序促进了对免疫肿瘤异质性的表达，这与肿瘤发生过程中肿瘤细胞的基因组异质性有关，作者对非小细胞肺癌(NSCLC)进行了TCR测序，发现不同肿瘤区域之间T细胞密度和克隆性存在显著差异，肿瘤内基因组和免疫异质性存在相关性，表明TCR肿瘤内异质性可能由不同肿瘤区域的特异性抗原驱动 (46)。

最近，Joshi及其同事还描述了NSCLC TCR库的异质性，并提供了更多证据表明TCR肿瘤内异质性反映了不同肿瘤区域的突变(103)。

在非小细胞肺癌转移以及其他癌症如黑色素瘤和肾细胞癌中也观察到显著的TCR肿瘤内异质性(104-106)。

除了表征肿瘤内异质性外，TCR测序还可用于观察肿瘤间异质性。具体来说，作者的团队利用TCR测序来观察肺癌和黑色素瘤同步转移的异质T细胞谱，这些异质T细胞谱对应于异质突变和甲基化(104,105)。

通过这些研究，多个同步肿瘤的TCR测序能够在治疗前评估肿瘤的差异生长。在同一例患者中，除了病灶特异性治疗反应，靶向治疗和免疫检查点封锁之间的转移在同一患者(105)。

总之，TCR肿瘤内和肿瘤间异质性在阐明癌症免疫机制和预测免疫治疗反应方面具有重要意义。

除了提供异质性信息外，TCR测序还提供了一种通过免疫监测来跟踪肿瘤进化的方法。

Dejima和他的同事发现，随着肺癌从癌前病变发展为浸润性肺腺癌，T细胞介导的抗肿瘤免疫功能会下降。具体来说，随着肺癌恶性程度的加重，免疫激活通路下调，免疫抑制通路上调，T细胞克隆性和t细胞肿瘤浸润减少(108)。

Cui和他的同事报道，在从宫颈上皮内瘤变到宫颈癌的过程中，外周血中TCR库的多样性逐渐减少，并且在患者之间存在具有相似CDR3基序的特异性克隆型(109)。

肿瘤发展过程中免疫学趋势的识别有助于肿瘤的分类分级以及帮助优化基于癌症分期的免疫疗法。

基于最近的观察，癌症相关TCR与正常组织中的TCR具有相似的生化特征，Beshnova和同事开发了一种名为DeepCAT(癌症相关TCR的深度CNN模型)的机器学习方法，以预测患者外周血中是否存在癌症相关的TCR。DeepCAT在区分癌症患者和健康个体方面表现出很高的预测准确性，对几种早期癌症(包括乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤)的AUC高于0.95。总的来说，DeepCAT代表了一种潜在的无创早期癌症检测方法(110)。

免疫疗法的发展和特性

TCR测序是当前T细胞治疗所必需的。过继性T细胞转移治疗以前依赖于自体输注扩大的肿瘤浸润性T细胞;然而，由于肿瘤浸润组中新抗原特异性T细胞的频率较低，许多患者对这种治疗没有反应(111)。

表达新型TCRs的基因修饰T细胞在内的T细胞疗法的进展已经发展到可以引发肿瘤特异性的肿瘤细胞免疫反应(112) 。

通过鉴定最佳靶抗原和肿瘤抗原特异性TCR, TCR测序在提高T细胞治疗的疗效方面发挥着重要作用(11,113)。

分离的新抗原特异性T细胞可以进行整体或单细胞TCR测序，以鉴定肿瘤内的显性TCR克隆型(111)。

除了推动T细胞疗法的特异性，TCR测序也可以作为一种评估和跟踪免疫治疗后的T细胞克隆型的工具。例如，通过对TCRβ链可变区域的深度测序，跟踪了一名经过过继细胞治疗后肿瘤消退的转移性结直肠癌患者体内TCRs对突变体KRAS G12D发生反应的频率。发现输注后一段时间没有检测到最主要的克隆型，而不太主要的克隆型持续存在(114)。此外，对TCRβ链的测序显示，嵌合抗原受体(CAR-T)细胞的克隆多样性在急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤患者的血液中最高，并随着时间的推移而下降。还发现单个T细胞克隆型表现出不同的克隆动力学，并在回输后对CAR-T细胞池产生不同的影响(115)。

对TCR库的分析也使研究人员能够阐明免疫治疗的潜在作用机制，以及它对免疫细胞的影响。Sipuleucel-T是一种自体细胞疗法，也是一种癌症疫苗，其中APCs被激活以对抗前列腺酸磷酸酶抗原，该抗原在前列腺癌中广泛表达(116)。Sheik及其同事利用TCR测序来表征sipuleucel-T的作用机制。他们发现，治疗促进了T细胞进入前列腺的募集，而不是促进T细胞克隆的扩张，因为循环T细胞的多样性减少了，而肿瘤浸润的多样性也减少了T细胞增加(117)。

在另一项研究中，Wieland及其同事利用TCR测序检测了黑色素瘤患者外周血和肿瘤浸润CD8⁺T细胞的组成，这些细胞在抗PD-1治疗后被激活，他们在外周血中发现了CD8⁺T细胞的DA单克隆库，并表明大多数显性外周血克隆在治疗后没有扩增，而在切除的肿瘤中发现克隆扩增。

预测患者预后、治疗反应和毒性

除了为免疫疗法的发展提供信息外，TCR测序和衍生的TCR库指标在预测患者预后方面具有实用价值。

TCR多样性代表了黑色素瘤患者的预后生物标志物，在黑色素瘤患者中，外周血和淋巴结转移中t细胞均匀度和丰富度更高的患者具有更长的无进展生存期和总生存期(119)。

肿瘤浸润性T细胞基线TCR库多样性的增加被发现对多种癌症的预后有影响，包括乳腺癌、黑色素瘤、肺癌和肾癌(120)。

在一项针对高级别浆液性卵巢癌的研究中，高T细胞克隆性结合基因组不稳定性特征(包括同源重组缺陷和拷贝数变异)或T细胞浸润到肿瘤中导致高预后价值(121)。

此外，扩增的T细胞对来自高变异等位基因频率突变的新抗原具有更高亲和力的患者，更有可能在肺癌和黑色素瘤中表现出更好的预后和对免疫疗法的反应(35).

TCR库也可用于预测患者对不同癌症免疫疗法的反应。晚期黑色素瘤患者在接受ipilimumab(一种CTLA-4抑制剂)治疗之前，外周血中TCR多样性的丰富度和均匀度都有所增加，与治疗相比，临床获益更大(122)。

一项针对晚期非小细胞肺癌的研究表明，在治疗期间外周血中TCR含量较高的患者从抗PD-1免疫治疗中获得了最大的临床益处，同时也延长了无进展生存期和总生存期。在同一项研究中，以治疗前和不同治疗时间点之间的Jaccard相似指数值较高的患者显示出改善的无进展生存期，凸显了治疗期间免疫监测的重要性(123)。

在经典霍奇金淋巴瘤患者中，TCR库基线增加和治疗期间的克隆性增加与nivo-lumab（一种PD-1抑制剂）的显著反应有关，两者在基线时都增加了TCR库的多样性，患者对PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)有显著的应答，而对PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)有显著的应答，经典霍奇金淋巴瘤患者，以及EBV阳性鼻咽癌患者自体EB病毒(EBV)扩展CTLs免疫治疗。

此外，在治疗前肿瘤浸润T细胞更高的TCR克隆性可预测转移性黑色素瘤患者抗PD -1免疫治疗的疗效(120)。

虽然癌症免疫疗法促进了显著的抗肿瘤免疫反应，但它们也有可能引起与炎症相关的毒性反应。除了作为预后和预测患者预后和免疫治疗反应的生物标志物外，TCR测序也可以提供与潜在的免疫治疗相关的毒性反应的信息。在接受抗CTLA-4治疗的前列腺癌患者中，克隆性的检测与免疫相关不良事件（irAE）有关；在外周血中扩增了55个以上CD8+T细胞克隆体预示着严重的irAE的发展（126）。另一项研究将CD4⁺记忆T细胞在患有黑色素瘤患者的外周血中的密度和多样性与抗-PD-1单一疗法和抗-PD-1和抗-CTLA-4联合疗法的严重irAE的发展相关联（127）。

TCR库测序指标可能与积极和消极的临床结果相关联，TCR测序可以为开发个性化的免疫治疗方法提供信息，以提高治疗效果和避免不必要的风险。(图4)。

4.TCR测序在癌症之外的应用

TCR测序的实用性不仅仅限于癌症应用。由于T细胞及其TCR通过识别和消除不相容的组织在哺乳动物异体反应中起着不可或缺的作用，研究人员利用TCR测序来表征器官移植的反应(128)。

具体来说，TCR库可以通过T细胞介导的排斥反应和移植物抗宿主病提供排斥风险的信息，并已在肾、肝和造血干细胞移植方面进行了评估(129-132)。

除了移植外，TCR测序在生物学表征、疾病分层和自身免疫性疾病监测方面也有潜在的应用。例如，通过分析TCR基因库，研究人员已经深入了解了多发性硬化症中的空间T细胞动态，确定了乳糜泻具有特异性的TCR克隆型，并定义了I型糖尿病中的克隆型扩增和TCR链配对(133-135)。

T细胞在对病原体的免疫反应中起着重要作用。因此，TCR测序对于研究适应性免疫动态、监测感染进展以及开发针对多种不同病毒感染(包括SARS-CoV-2)的新型免疫疗法具有重要价值(136,137)。在其他健康状况下，如缺血性心脏病和急性冠状动脉综合症，可以进行TCR谱系分析以进行风险分层和诊断(138,139)。

总的来说，这表明TCR测序和TCR免疫库可以用于许多生物学领域的研究，并且在生物医学领域中具有非常广泛的应用前景(图4)。

TCR测序是描述免疫反应的工具，了解TCR库的性质，并有助于鉴定TCR抗原对。具体到癌症，TCR测序有助于肿瘤异质性和肿瘤进化的基本特征。从临床角度来看，TCR测序既是T细胞免疫疗法的基础，也是评估各种免疫疗法疗效的工具。此外，从测序数据分析中得出的TCR库指标可以作为许多不同癌症类型患者预后、抗癌治疗反应和免疫相关毒性风险的重要预测指标。

NGS方法和TCR数据分析工具不断改进，展示出更大的处理能力并扩展了研究和临床应用。